湯亞飛, 林 祺, 佘小漫, 李正剛, 于 琳, 藍國兵, 何自福*

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室, 廣州 510640;2. 華南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 廣州 510642)

植原體phytoplasma是一類專性寄生、不能人工培養(yǎng)的植物病原物,隸屬于細菌界Bacteria軟壁菌門Tenericutes柔膜菌綱Mollicutes無膽甾原體目Acholeplasmatales無膽甾原體科Acholeplasmataceae植原體暫定屬Ca.genus Phytoplasma[1-2]。植原體主要通過具有刺吸式口器的昆蟲傳播,也可通過嫁接或菟絲子傳播,寄主范圍廣泛,可侵染1 000多種植物,常引起叢枝、花變?nèi)~、黃化、小葉、衰退、矮化等典型癥狀,給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成較大的損失[3]。中國已報道了100多種植原體相關(guān)病害[4],如棗瘋病(jujube witches’-broom disease)[5-6]、小麥藍矮病(wheat blue dwarf disease)[7-8]、馬鈴薯僵頂病(potato stolbur disease)[9]、櫻桃叢枝或花變?nèi)~病(cherry witches’-broom or phyllody disease)[10-11]等。國際上，依據(jù)16S rRNA 基因核苷酸序列一致性、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)結(jié)果對植原體進行分類，目前植原體包括52個暫定種(‘CandidatusPhytoplasma’),34個組(group)和100多個亞組(subgroup)[3]。

花生是我國重要的油料和經(jīng)濟作物之一,是廣東省第二大農(nóng)作物,全省種植面積常年保持在30萬～35萬hm2,僅次于水稻[12]。花生叢枝植原體(peanut witches’-broom phytoplasma,PnWB)引起花生叢枝病[13],在我國南方花生產(chǎn)區(qū)發(fā)生較為普遍?；ㄉ鷧仓Σ√镩g主要表現(xiàn)為植株節(jié)間縮短,產(chǎn)生大量腋芽,叢生枝條上葉片變小,大多數(shù)植株不接莢果,民間俗稱“花生公”,嚴重影響花生的產(chǎn)量。

我國花生叢枝病于1952年首次在廣州發(fā)現(xiàn)[14]。該病害被發(fā)現(xiàn)以來,我國不少學者對其開展了相關(guān)研究,20世紀80年代初,通過昆蟲介體傳病試驗證明華南花生叢枝病是由小綠葉蟬EmpoascaflavescensFab.傳播的類菌原體(現(xiàn)稱植原體)病[15];同年,通過電子顯微鏡從海南花生叢枝病病樣中觀察到類菌原體[16]。1994年,對華南花生叢枝病的發(fā)病規(guī)律及防治方法開展了相關(guān)研究[14]。2000年,開展了花生叢枝病病原的血清學研究[17]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,不少學者已對引起海南、云南、臺灣等省花生叢枝病的相關(guān)植原體的16S rRNA、SecY、rp等多個基因進行克隆和序列分析[13,18-21]。尚未見廣東花生叢枝病的植原體分子特征及相關(guān)基因序列分析的報道。本研究采用分子生物學方法對廣東采集的花生叢枝病進行了病原鑒定,明確了植原體株系分類地位,為進一步開展花生植原體病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1樣品采集

2020年10月,在廣東省湛江市遂溪縣花生種植地隨機采集了7份花生叢枝病樣,病株田間癥狀表現(xiàn)典型叢枝、小葉(圖1)。

圖1 廣東省花生叢枝病田間癥狀Fig.1 Symptoms of peanut witches’-broom disease in fields in Guangdong province

1.1.2主要試劑和儀器設(shè)備

植物基因組DNA抽提試劑盒(EasyPure Plant Genomic DNA Kit)和大腸桿菌EscherichiacoliT1感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 plus dye)和載體pMD 19-T購自寶生物工程(大連)有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒(GeneJET Gel Extraction Kit)購自美國Thermo(賽默飛)公司;氨芐青霉素、X-Gal、蔗糖、瓊脂糖和胰蛋白胨購自生工生物工程(上海)股份有限公司;GoldView核酸染料購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;其他常規(guī)分析純試劑購自廣州市芊薈化玻儀器有限公司。T100TMThermal cycler PCR儀、Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)以及電泳儀均購自美國BIO-RAD公司;植物組織自動研磨儀MM400購自德國Retsch(萊馳)公司。

1.2 試驗方法

1.2.1病樣總DNA提取

取待測花生病株葉片100 mg置于裝有鋼珠的2 mL圓底離心管,將其裝入植物組織自動研磨儀的適配器,然后浸入液氮中冷卻2 min左右,取出后移至主機快速固定即可開始研磨,以頻率1 200次/min,時間為90 s,進行振蕩破碎,結(jié)束后迅速取出粉末,按照植物DNA提取試劑盒(EasyPure Plant Genomic DNA Kit)說明書上的步驟進行總DNA抽提,DNA沉淀溶解于50 μL ddH2O中,于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.216S rRNA基因的擴增

利用擴增植原體16S rRNA基因的通用引物P1/P7[22-23]、R16mF2/R16mR1[24],對待測病樣總DNA進行PCR檢測,預期擴增目的片段大小分別為1.8 kb和1.4 kb。反應體系25 μL:待測樣品總DNA 1 μL(約20 ng),ExTaqTMPremix 12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL,滅菌水9.5 μL。反應程序:95℃ 預變性4 min;95℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 2 min,35個循環(huán);72℃ 延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.3SecY基因的擴增

利用擴增植原體SecY基因的通用引物L15F1/MapR1和SecYF2(Ⅱ)/SecYR1(Ⅱ)[19],對待測病樣總DNA進行巢式PCR擴增,目的片段大小為1.7 kb。PCR反應體系25 μL:待測樣品總DNA 1 μL (約20 ng),ExTaqTMPremix 12.5 μL,引物L15F1/MapR1 (10 μmol/L)各1 μL,滅菌水9.5 μL。反應程序:95℃ 預變性4 min;95℃ 1 min,48℃ 1 min,72℃ 2 min,30個循環(huán);72℃延伸10 min。巢式PCR反應體系25 μL:第一輪PCR產(chǎn)物 1 μL,ExTaqTMPremix 12.5 μL,引物SecYF2(Ⅱ)/SecYR1(Ⅱ) (10 μmol/L)各1 μL,滅菌水9.5 μL。反應程序:95℃ 預變性4 min;95℃ 30 s,55℃ 1 min,72℃ 90 s,35個循環(huán);72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.4基因克隆與測序

采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Gene JET Gel Extraction Kit)回收目的條帶,將回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD-19T載體上。具體操作:pMD-19T 1 μL、2×solution I連接反應緩沖液5 μL、回收DNA目的片段4 μL混勻,在16℃條件下反應過夜。采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T1感受態(tài)細胞,在含100 μg/mL Amp、40 μL/mL X-Gal的LB固體培養(yǎng)基上,37℃倒置培養(yǎng)過夜;從每個平板隨機挑取3個陽性白色單菌落送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.5序列分析

利用DNAStar的SeqMan對測序獲得的基因序列進行拼接,去掉載體序列,將所得DNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中進行BLASTn搜索,確定是否為植原體基因序列;進一步將16S rRNA基因片段序列通過植原體在線分類軟件iPhyClassifier(https:∥plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi)計算相似系數(shù)和虛擬RFLP(Virtual RFLP)分析,確定其植原體組和亞組[25]。利用在線分析工具MUSCLE(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/),將所獲得的16S rRNA和SecY基因序列與已登錄GenBank的相關(guān)序列進行一致性分析。采用MEGA 6.06的鄰接法(neighbor joining,NJ)[26]構(gòu)建基于16S rRNA和SecY基因的系統(tǒng)進化樹,bootstrap值設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 植原體PCR檢測結(jié)果

利用擴增植原體16S rRNA的通用引物P1/P7、R16mF2/R16mR1對采集的7份花生叢枝病樣進行PCR檢測,結(jié)果兩對引物均能從7份病樣的總DNA中擴增出與預期目的片段大小一致的條帶,陰性對照中未擴增出任何片段(圖2a、b)。進一步利用擴增SecY基因的通用引物L15F1/MapR1和SecYF2(Ⅱ)/SecYR1(Ⅱ)對7份花生叢枝病樣進行巢式PCR擴增,5份病樣總DNA中擴增出與預期目的片段大小一致的特異性條帶,陰性對照中未擴增出任何片段(圖2c)。這些結(jié)果表明,采集于廣東省湛江市遂溪縣的花生叢枝病樣中存在植原體。將該株系命名為廣東花生叢枝植原體(PnWB-GDSX-2020)。

圖2 花生叢枝病樣中植原體16S rRNA、SecY基因PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR detection result of 16S rRNA and SecY genes of phytoplasma in peanut witches’-broom samples

2.2 16S rRNA基因序列分析

隨機挑取1個病樣的PCR產(chǎn)物進行克隆、測序、分析,結(jié)果表明，從廣東遂溪花生病樣中獲得的16S rRNA片段大小為1 430 bp (GenBank登錄號為MZ427281),BLASTn結(jié)果顯示,與該片段有較高一致性的序列均為16SrⅡ組 (Peanut WB group)成員的16S rRNA序列。進一步利用在線分析工具MUSCLE(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)對廣東花生叢枝植原體(PnWB-GDSX-2020)的16S rRNA與GenBank數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)相關(guān)序列進行了核苷酸一致性分析(表1),結(jié)果顯示，PnWB-GDSX-2020與已報道的花生叢枝植原體組(16SrⅡ組)的16S rRNA核苷酸序列一致性在97%以上,與來自中國廣東、海南、臺灣的16SrⅡ-A、16SrⅡ-D和16SrⅡ-V亞組的11個植原體的一致性為100%,與來自中國海南和云南花生叢枝植原體的一致性為99.93%;而與其他亞組植原體的一致性較低,其中與16SrⅠ和16SrⅣ組植原體的一致性分別為89.47%和90.81%。

2.3 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化分析

采用MEGA 6.06的鄰接法構(gòu)建了PnWB-GDSX-2020 16S rRNA與GenBank數(shù)據(jù)庫中36個植原體的系統(tǒng)發(fā)育樹,以柑橘黃龍病菌亞洲種廣東株系(CandidatusLiberibacter asiaticus isolate Guangdong-HP)(GenBank登錄號: DQ432005)的16S rRNA序列為外組。結(jié)果(圖3)顯示,PnWB-GDSX-2020與16Sr Ⅱ組的植原體株系聚集在一個大分支,與16Sr Ⅱ-A、16Sr Ⅱ-D、16Sr Ⅱ-V和16Sr Ⅱ-X亞組植原體株系形成一個小的分支,親緣關(guān)系最近;而與16Sr Ⅰ和16Sr Ⅳ組的植原體親緣關(guān)系遠。

表1 PnWB-GDSX-2020與其他植原體的16S rRNA基因序列一致性1)

續(xù)表1 Table 1(Continued)

圖3 PnWB-GDSX-2020與其他36個植原體代表株系基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequences of PnWB-GDSX-2020 and 36 other phytoplasmas

2.4 16S rRNA基因序列的iPhyClassifier在線分析

將獲得的PnWB-GDSX-2020 16S rRNA基因序列利用植原體在線分類軟件iPhyClassifier進行分析。結(jié)果顯示PnWB-GDSX-2020 16S rRNA序列與‘CandidatesPhytoplasma australasiae’ 菌株(GenBank登錄號:U15442)的一致性最高,為98.5%,這說明PnWB-GDSX-2020是‘CandidatusPhytoplasma australasiae’的相關(guān)菌株;PnWB-GDSX-2020 16S rRNA序列片段的17種限制性內(nèi)切酶虛擬RFLP 圖譜與16SrⅡ-V亞組的參照株系‘Praxelisclematidea’ phyllody phytoplasma (GenBank 登錄號:KY568717) 酶切圖譜一致(相似系數(shù)1.00),表明PnWB-GDSX-2020屬于16SrⅡ-V亞組成員。

2.5 SecY基因序列分析

利用擴增SecY基因的通用引物,從廣東遂溪花生病樣總DNA中PCR擴增獲得該基因片段,其大小為1 709 bp (GenBank登錄號為MZ437794),其中該片段序列318-1580 nt為完整SecY基因序列,編碼420個氨基酸。BLASTn結(jié)果顯示,與該片段有較高一致性的序列均為16SrⅡ組成員的SecY基因序列。進一步利用在線分析工具MUSCLE對PnWB-GDSX-2020的SecY基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)相關(guān)序列進行核苷酸一致性分析，結(jié)果(表2)表明,PnWB-GDSX-2020與已報道的16SrⅡ組的SecY基因核苷酸序列一致性在98%以上,其中與來自中國云南、中國臺灣、印度的15個植原體的SecY基因核苷酸一致性為98.83%～99.82%;而與其他亞組植原體的SecY基因核苷酸序列一致性較低,其中與16SrⅠ和16SrⅤ組植原體的一致性分別為64.05%和69.74%。進一步采用MEGA 6.06的鄰接法,構(gòu)建了PnWB-GDSX-2020SecY與GenBank數(shù)據(jù)庫中17個植原體的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果(圖4)顯示,PnWB-GDSX-2020與16SrⅡ組的植原體株系聚集在一個大分支,親緣關(guān)系最近;與16SrⅠ和16SrⅤ組的植原體親緣關(guān)系遠。

表2 PnWB-GDSX-2020與其他植原體的Sec Y基因序列一致性1)

圖4 PnWB-GDSX-2020與其他17個植原體代表株系基于SecY 基因序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on SecY gene sequences of PnWB-GDSX-2020 and 17 other phytoplasmas

3 結(jié)論與討論

本研究通過PCR擴增、克隆、測序獲得廣東花生叢枝病相關(guān)植原體(PnWB-GDSX-2020)的16S rRNA和SecY基因序列,進一步通過對16S rRNA基因序列的iPhyClassifier在線分析、序列一致性和系統(tǒng)進化分析,明確廣東花生叢枝病相關(guān)植原體為16SrⅡ-V亞組植原體。同時,SecY基因序列分析結(jié)果也顯示,PnWB-GDSX-2020與花生叢枝植原體組的一致性最高,親緣關(guān)系最近。廣東花生叢枝病于20世紀50年代就有發(fā)生,至今僅見通過電子顯微鏡觀察、介體和嫁接傳病來鑒定其病原的報道,本文從分子水平明確了廣東花生叢枝病相關(guān)植原體,并確定了其分類地位,這些結(jié)果為開展植原體16S rRNA和SecY基因序列變異與進化等研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

植原體是一類不能人工培養(yǎng)的植物病原細菌,分類鑒定主要依據(jù)16S rRNA、rp、SecY等保守基因序列分析。本文利用擴增16S rRNA基因的兩對通用引物從7份花生病樣中均擴增出條帶,而經(jīng)過多次試驗通過SecY基因的通用引物進行巢式PCR僅能從5份病樣中擴增出目的條帶,其他2份病樣未能擴增出條帶。16S rRNA基因是植原體高度保守基因,也是目前植原體分類的主要分子依據(jù),而rp、SecY等其他基因遺傳變異較大。本文擴增SecY基因序列采用的引物位于rpl15和map基因之間,擴增的目的片段包含部分rpl15基因、完整SecY基因以及部分map基因,推測2份樣品未能擴增出目的條帶是由于引物結(jié)合位點的植原體基因序列發(fā)生變異導致。

植原體病害種類多,寄主范圍廣,已在農(nóng)林領(lǐng)域造成嚴重危害。病原種類鑒定是指導相關(guān)病害防控的前提。而用于植原體檢測與鑒定的技術(shù)主要有組織學觀察、生物學方法、血清學檢測、分子檢測技術(shù)。廣東省常年高溫高濕,植物和介體昆蟲都可以周年生長與繁殖,植原體等各類植物病害發(fā)生嚴重。不少學者采用不同鑒定技術(shù)對廣東相關(guān)植原體病害進行鑒定。如20世紀80年代通過組織學觀察和生物學方法明確廣東地區(qū)的花生叢枝病、芝麻花變?nèi)~病是由植原體引起的[14,27];1994年,同樣采用組織學觀察和生物學方法明確水稻橙葉病是一種植原體引致的新病害[28]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,2019年通過分子檢測技術(shù)明確廣東棗瘋病植原體屬于16SrⅤ-B亞組[29],廣東茄子花變?nèi)~病植原體屬于16SrⅡ-D亞組[30]。本文通過分子生物學技術(shù)確定了廣東花生叢枝病植原體屬于16SrⅡ-V亞組,且與先前報道的茄子花變?nèi)~、豆角花變?nèi)~相關(guān)植原體16S rRNA基因序列(GenBank登錄號:MH667642、MW426146)一致性100%,但茄子花變?nèi)~植原體病害發(fā)生在粵東惠州、豆角花變?nèi)~植原體病害發(fā)生在粵西湛江,由此初步推測,該植原體病害極有可能通過介體昆蟲的傳播在全省蔓延,這一研究結(jié)果為廣東省植原體病害的防控提供了科學依據(jù)。