肖劍偉，蔡旭，郭粉蓮，尹志華，陳新鵬，葉志中

深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病專科醫(yī)院，廣東 深圳 518000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)已成為影響全球0.5%～1.0%人口的常見病之一[1]。作為一種慢性自身免疫性疾病，RA滑膜組織內(nèi)細(xì)胞的死亡刺激可導(dǎo)致炎癥進(jìn)一步加重，加快疾病進(jìn)程。脂質(zhì)過氧化誘發(fā)的鐵死亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種非凋亡的細(xì)胞死亡方式，近十年來得到了廣泛的研究[2]。大量研究顯示，鐵死亡在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，如癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[3-4]。淫羊藿苷能夠通過系統(tǒng)Xc-/谷胱甘肽過氧化物酶4(system Xc-/glutathione peroxidase 4，Xc-/GPX4) 軸抑制鐵死亡，從而增強(qiáng)脂多糖誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞活力[5]，提示鐵死亡在RA的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，調(diào)控鐵死亡過程成為一個(gè)新的治療RA的潛在靶點(diǎn)。

目前，常見的治療RA的藥物包括非甾體類、抗風(fēng)濕病藥物、生物制劑等，雖然效果明顯，但不良反應(yīng)也日益凸顯。隨著中藥在疾病中的應(yīng)用越來越受到重視，從中藥中挖掘潛在的分子用來治療疾病已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。二妙散是中醫(yī)藥治療痹癥的經(jīng)典方劑，由蒼術(shù)和黃柏組成，具有治療濕熱下注、筋骨疼痛之作用。研究顯示，二妙散對(duì)RA患者具有明顯療效[6]，然而其作用機(jī)制尚不明確。本研究以加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(weighted gene co-expression network，WGCNA)分析為基礎(chǔ)，結(jié)合分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)技術(shù)探索二妙散通過影響鐵死亡治療RA的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)材料以“ rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中檢索下載數(shù)據(jù)集。見表1。

表1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)譜

1.2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析選取方差>50%的基因，在R軟件中使用“WGCNA”包[7]進(jìn)行分析。選擇合適的軟閾值(β)，將系統(tǒng)聚類樹(MEDissThres)設(shè)置為0.25以合并相似的模塊。將矩陣數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為鄰接矩陣并基于拓?fù)渲丿B進(jìn)行聚類，設(shè)置模塊至少含50個(gè)基因。將GSE77298數(shù)據(jù)集設(shè)置為正常組及RA組，構(gòu)建臨床信息并計(jì)算基因顯著性。選擇相關(guān)性最大的模塊中的基因，通過string網(wǎng)站進(jìn)行基因本體(gene oncology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析。

1.3 二妙散活性成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[8]檢索二妙散組方中藥黃柏、蒼術(shù)的化學(xué)成分，設(shè)定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，篩選得到活性成分及其作用靶點(diǎn)，使用Cytoscape軟件繪制“二妙散-活性成分-活性成分靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)及二妙散調(diào)控鐵死亡治療RA的潛在靶點(diǎn)獲取通過FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)[9]獲取鐵死亡相關(guān)基因。將結(jié)果與1.2中與臨床相關(guān)性最強(qiáng)的模塊基因及二妙散活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行映射取交集，獲得二妙散調(diào)控鐵死亡治療RA的潛在靶點(diǎn)。

1.5 治療靶點(diǎn)多數(shù)據(jù)集驗(yàn)證分別在GSE55235和GSE55457數(shù)據(jù)集中，通過t檢驗(yàn)分析二妙散調(diào)控鐵死亡治療RA的潛在靶點(diǎn)在正常組及RA組滑膜組織中的表達(dá)情況。

1.6 分子對(duì)接在RCSB PDB(www.rcsb.org/)獲取靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)，采用Pymol[10]去除晶體水后使用AutoDock對(duì)蛋白進(jìn)行加氫及電荷。從Pubchem獲取活性小分子成分結(jié)構(gòu)，使用ChemBio3D進(jìn)行能量最小化。使用AutoDock Vina進(jìn)行半柔性分子對(duì)接并選取結(jié)合能最小的復(fù)合物體系作為最佳配體。使用ligplot+計(jì)算和繪制復(fù)合物的氫鍵和疏水鍵。

1.7 分子動(dòng)力學(xué)分子動(dòng)力學(xué)模擬使用Gromacs 2020.3軟件進(jìn)行[11]。在ATB網(wǎng)站[12]上傳化合物小分子結(jié)構(gòu)，將其轉(zhuǎn)換為Gro格式并生成位置限制文件。使用Gromacs內(nèi)置pdb2gmx命令分別生成靶蛋白坐標(biāo)文件及拓?fù)湮募?。將小分子及蛋白的Gro格式合并為復(fù)合物的Gro文件。力場(chǎng)選用Gromos54a7_atb，水分子模型選用SPC，創(chuàng)建大小為 1.0 nm 的十二面體水盒子。根據(jù)計(jì)算結(jié)果加入鈉離子中和電荷，使模擬系統(tǒng)總電荷為0 C。將動(dòng)力學(xué)模擬體系的溫度設(shè)定為300 K。采用最速下降法優(yōu)化后進(jìn)行NVT和NPT 系綜平衡，最后進(jìn)行總時(shí)長(zhǎng)為20 ns的動(dòng)力學(xué)模擬，步長(zhǎng)設(shè)定為2fs。去除體系的周期性邊界并提取20 ns時(shí)的最終復(fù)合物構(gòu)象。使用VMD[13]、Pymol進(jìn)行可視化處理，計(jì)算復(fù)合物的均方根偏差(root mean squared deviation，RMSD)、溶劑可及表面(solvent accessible surface area，SASA)、蛋白回旋半徑(gyrate，GR)，并通過Gromacs插件 g_mmpbsa計(jì)算結(jié)合自由能[14]，通過拉氏圖評(píng)估動(dòng)力學(xué)模擬后蛋白結(jié)構(gòu)的合理性。

2 結(jié)果

2.1 WGCNA結(jié)果GSE77298數(shù)據(jù)集共涉及 10 827 個(gè)基因納入網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。β值一般選擇在平均連接度變化呈平穩(wěn)處，值在16以下，且R方要高于0.8，本研究選擇β=12作為軟閾值，見圖1，圖中縱軸代表對(duì)應(yīng)網(wǎng)絡(luò)log(k)與log(p(k))相關(guān)系數(shù)的平方，相關(guān)系數(shù)的平方越高，說明該網(wǎng)絡(luò)越逼近無網(wǎng)絡(luò)尺度的分布；紅線處對(duì)應(yīng)的上方的β值為本次最合適的β值，這意味著特征基因相關(guān)性高于0.9的模塊將被合并。因而選擇基于拓?fù)渲丿B以及分配的模塊顏色，對(duì)具有相似性基因的樹狀圖進(jìn)行聚類，并對(duì)基因相關(guān)性高于0.9的模塊進(jìn)行合并，見圖2，每個(gè)彩色行代表一個(gè)顏色編碼的模塊，其包含一組高度相關(guān)的基因，共確定12個(gè)模塊。對(duì)各模塊進(jìn)行臨床信息相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，黃色模塊的相關(guān)性為+0.57和-0.57，其中正值表示正相關(guān)，負(fù)值表示負(fù)相關(guān)，且黃色模塊的P值為0.004，即黃色模塊相關(guān)性最大且P值最小，見圖3及圖4，因而選取黃色模塊進(jìn)一步進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG信號(hào)通路相關(guān)分析，見圖5，該黃色模塊共含有744個(gè)基因，GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)92條分子功能、732條生物學(xué)過程及130條細(xì)胞成分，其中分子功能(molecular function，MF)涉及腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等，生物學(xué)過程(biological process，BP)涉及免疫系統(tǒng)過程等，細(xì)胞成分(cellular component，CC)主要定位于囊泡等。KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)75條信號(hào)通路，主要涉及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)信號(hào)通路、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)通路等，與RA疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

圖1 確定軟閾值圖

圖2 聚類分析合并后得到的模塊

注：每個(gè)方塊中上面的數(shù)字表示相關(guān)性(紅色方塊為正值表示正相關(guān)，綠色方塊為負(fù)值表示負(fù)相關(guān))，下面括號(hào)中數(shù)字代表P值圖3 各模塊與RA的相關(guān)性

圖4 黃色模塊各基因與臨床性狀相關(guān)性

注：5A：GO富集分析氣泡圖；5B：KEGG信號(hào)通路富集分析氣泡圖圖5 GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析氣泡圖

2.2 二妙散活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)基于TCMSP篩選得到蒼術(shù)和黃柏有效活性成分分別為9個(gè)和37個(gè)，兩者共同作用靶蛋白103個(gè)，將蒼術(shù)、黃柏有效活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制“二妙散-活性成分-活性成分靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。

注：橘紅色表示藥物；綠色表示有效活性成分；紫色表示靶點(diǎn)圖6 “二妙散-活性成分-活性成分靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 二妙散調(diào)控鐵死亡治療RA的相關(guān)靶點(diǎn)通過FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)獲得鐵死亡相關(guān)基因97個(gè)，與WGCNA分析中黃色模塊包含的744個(gè)基因及103個(gè)二妙散活性成分相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到二妙散調(diào)控鐵死亡治療RA的相關(guān)靶點(diǎn)1個(gè)，即花生四烯5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5)。見圖7。

圖7 二妙散調(diào)控鐵死亡治療RA的潛在靶點(diǎn)的韋恩圖

2.4 多數(shù)據(jù)集驗(yàn)證ALOX5表達(dá)結(jié)果在GSE55235與GSE55457數(shù)據(jù)集中分析ALOX5蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示，與正常組比較，不同數(shù)據(jù)集的RA組滑膜組織中ALOX5蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，見圖8。

圖8 滑膜組織中ALOX5蛋白的差異表達(dá)情況

2.5 分子對(duì)接結(jié)果黃柏、蒼術(shù)的有效活性成分中，槲皮素、漢黃芩素共同作用的靶點(diǎn)為ALOX5，因而，選擇槲皮素及漢黃芩素與ALOX5進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示，槲皮素、漢黃芩素均能夠與ALOX5形成多個(gè)氫鍵及疏水鍵，其中槲皮素與ALOX5的對(duì)接結(jié)合能為-9.4 kcal·mol-1，與Leu448、Gln549、Ala453、Ser447、Phe450、Arg457、Tyr470、Val243、Ile365、Thr366形成疏水作用；漢黃芩素與ALOX5的對(duì)接結(jié)合能為-9.1 kcal·mol-1，與Ile167、Arg401、Glu622、Asp166、Try100、His624、Phe393、Arg101形成疏水作用。見圖9。

圖9 分子對(duì)接示意圖

2.6 分子動(dòng)力學(xué)結(jié)果槲皮素-ALOX5及漢黃芩素-ALOX5 2個(gè)復(fù)合體系在長(zhǎng)達(dá)20 ns的整個(gè)模擬過程中，RMSD波動(dòng)小于0.2 nm并且在5 ns時(shí)達(dá)到平衡狀態(tài)，見圖10。復(fù)合物體系的GR越小，提示復(fù)合物在水溶液中的結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，見圖11。SASA結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，2個(gè)復(fù)合物體系的SASA逐漸縮小，提示其隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸趨于穩(wěn)定，見圖12。與模擬前對(duì)比，經(jīng)過20 ns的動(dòng)力學(xué)模擬后，漢黃芩素、槲皮素依然與ALOX5緊密結(jié)合。漢黃芩素與ALOX5結(jié)合后，小分子在活性口袋內(nèi)部移動(dòng)變化幅度較大且其Gyrate變化較明顯，考慮可能為活性小分子使蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抑制了靶蛋白的活性，見圖13。拉氏圖顯示，與槲皮素和漢黃芩素結(jié)合后，ALOX5蛋白99.7%和99.8%的氨基酸殘基均處在合理范圍內(nèi)，提示模擬后的蛋白結(jié)構(gòu)是可靠而且合理的，見圖14。結(jié)合自由能結(jié)果顯示，槲皮素與ALOX5之間主要通過范德華力、靜電勢(shì)能結(jié)合；漢黃芩素與ALOX5主要通過范德華力結(jié)合；極性溶劑化作用則抑制槲皮素、漢黃芩素與ALOX5的結(jié)合，見表2。

圖10 小分子蛋白復(fù)合物體系的RMSD

圖11 小分子蛋白復(fù)合物體系的蛋白回旋半徑

表2 槲皮素、漢黃芩素與ALOX5的結(jié)合自由能

表2 槲皮素、漢黃芩素與ALOX5的結(jié)合自由能

化合物受體蛋白范德華力靜電勢(shì)能極性溶劑化作用表面溶劑化作用結(jié)合自由能槲皮素ALXO5-113.91±13.71-139.82±19.95134.90±15.06-16.26±0.86-135.10±16.46漢黃芩素ALXO5-130.81±10.68-17.23±9.5055.59±20.67-16.20±1.01-108.66±21.53

圖12 小分子蛋白復(fù)合物體系的溶劑可及表面

圖13 分子動(dòng)力學(xué)模擬示意圖

圖14 分子動(dòng)力學(xué)模擬后ALOX5蛋白拉氏圖

3 討論

RA是最常見的慢性炎癥性疾病，反復(fù)的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致滑膜增厚，并引起關(guān)節(jié)腫脹[15]，越早啟動(dòng)治療，其癥狀緩解的可能性就越大[16]。炎癥通常是由有害刺激引發(fā)的，包括感染、細(xì)胞死亡和組織損傷等[17]。細(xì)胞凋亡和壞死是細(xì)胞死亡的主要形式，而鐵死亡是一種依賴于鐵和脂毒性的非caspase依賴性細(xì)胞死亡形式[18]，它是由非酶促(fenton)反應(yīng)和脂氧合酶(lipoxygenase，LOXs)引發(fā)，并由鐵催化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[19]。細(xì)胞死亡常伴隨著炎癥反應(yīng)，而在炎癥發(fā)生的過程中，花生四烯酸作為細(xì)胞膜脂質(zhì)的主要成分，通過3條代謝途徑代謝為生物活性促炎介質(zhì)前體，其中一條為L(zhǎng)OXs途徑，LOXs轉(zhuǎn)化為白三烯和脂氧素參與炎癥反應(yīng)[20]。LOXs家族成員之一ALOX5是觸發(fā)脂質(zhì)過氧化的關(guān)鍵酶[21]。研究表明，ALOX5抑制劑Zileuton通過抑制谷氨酸誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞鐵死亡起到神經(jīng)保護(hù)作用[22]。在脂肪性肝炎小鼠模型中，鐵死亡抑制劑羅格列酮和去鐵螯合劑去鐵酮能夠改善肝細(xì)胞死亡并抑制炎癥因子的表達(dá)[23]。綜上可見，鐵死亡可能是炎癥的啟動(dòng)因素，或者至少具有促炎作用，抑制鐵死亡可以抑制炎癥反應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，許多鐵死亡抑制劑(包括Fer-1、liproxstatin-1和LOXs抑制劑)可防止在鐵死亡期間fenton反應(yīng)驅(qū)動(dòng)的多不飽和脂肪酸的自氧化和非酶促反應(yīng)的破壞[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在RA滑膜組織中ALOX5蛋白表達(dá)水平明顯升高，由此推測(cè)ALOX5可能導(dǎo)致滑膜組織鐵死亡增加，導(dǎo)致炎癥進(jìn)一步加重，因此抑制滑膜組織的鐵死亡，可能能夠減輕炎癥，改善RA患者癥狀。

在RA疾病活動(dòng)期，患者以多關(guān)節(jié)疼痛為主要臨床表現(xiàn)，中醫(yī)認(rèn)為邪氣盛則實(shí)，其腫、熱屬于“邪實(shí)”的表現(xiàn)，導(dǎo)致滑膜循環(huán)血流淤滯，實(shí)驗(yàn)室檢查可見炎癥指標(biāo)明顯升高，推測(cè)局部血管循環(huán)的變化是RA的基本病理因素之一；同時(shí)，炎癥過程中產(chǎn)生的各種炎癥介質(zhì)、自身抗體等可作為毒邪入侵而影響氣血運(yùn)行，導(dǎo)致脈絡(luò)淤滯。上述這類變化與中醫(yī)的“瘀”一致，故中醫(yī)治療RA以攻邪為主，扶正為輔，給予行瘀、清熱、除濕之法，與西醫(yī)的抗炎治療具有相同的含義。二妙散治療RA已取得了明確的療效，可減少IL-1β分泌，對(duì)炎癥產(chǎn)生抑制作用[26-27]，提示二妙散能夠通過減輕炎癥反應(yīng)改善RA患者的癥狀。而本研究亦顯示，二妙散可能通過影響鐵死亡來抑制炎癥反應(yīng)，以上研究結(jié)果與二妙散清熱燥濕化瘀之功效具有異曲同工之處。

本研究結(jié)果顯示，漢黃芩素、槲皮素與ALOX5之間的結(jié)合自由能較低，經(jīng)過動(dòng)力學(xué)模擬后仍與ALOX5緊密結(jié)合。研究顯示，漢黃芩素通過抑制ALOX5減少乳腺癌細(xì)胞的侵襲和炎癥[28]?；⒄忍崛∥镏婚纹に啬軌蛞种颇[瘤細(xì)胞中ALOX5的活性[29]。張良等研究顯示，槲皮素能夠通過抑制前列腺組織內(nèi)ALOX5表達(dá)改善自身免疫性慢性前列腺炎[30]。根據(jù)以上研究推測(cè)，漢黃芩素、槲皮素均能使ALOX5活性降低，從而減少鐵死亡，減輕炎癥反應(yīng)。二妙散中黃柏苦寒清除濕熱，為治下焦?jié)駸嶂?；蒼術(shù)苦溫辛燥，兩者配伍能夠寒溫協(xié)調(diào)，陰陽(yáng)相濟(jì)，從而達(dá)到清熱燥濕，標(biāo)本兼顧的治療效果。而槲皮素作為黃柏的主要成分，與ALOX5具有較低的結(jié)合自由能，在治療中發(fā)揮著更大的作用，這與二妙散中黃柏作為主藥是相符合的。二妙散為復(fù)方中藥湯劑，在治療中具有多組分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，不同的成分也可作用于同一靶點(diǎn)，發(fā)揮協(xié)同作用。本研究從鐵死亡角度闡述了二妙散可能通過影響滑膜組織中ALOX5的活性，減少鐵死亡，進(jìn)而降低滑膜中的炎癥反應(yīng)，為進(jìn)一步驗(yàn)證和開發(fā)提取中藥有效成分治療RA提供了理論依據(jù)。

綜上，基于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析和分子動(dòng)力學(xué)探討發(fā)現(xiàn)二妙散可通過調(diào)控滑膜組織中ALOX5的活性減少鐵死亡進(jìn)而改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。然而，本研究結(jié)果需要進(jìn)一步通過使用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)來驗(yàn)證。