林園園，肖鋒

湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430074

腎纖維化是由功能腎元的丟失、成纖維細(xì)胞的積累和過量的基質(zhì)蛋白引起的[1]，最終會導(dǎo)致腎臟組織結(jié)構(gòu)破壞及腎功能完全喪失，引起腎硬化。研究表明，腎纖維化作為腎硬化發(fā)展過程的必經(jīng)階段，具有可逆性[2]。許多分子調(diào)節(jié)劑如細(xì)胞因子、生長因子、代謝毒素和應(yīng)激分子被報道可調(diào)節(jié)腎纖維化的進(jìn)展，其中，轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)在腎纖維化的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色[3]。TGF-β可導(dǎo)致腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的激活及細(xì)胞外基質(zhì)的過度累積[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對腎纖維化的特異性治療鮮見報道，而中醫(yī)則顯示出良好的效果。傳統(tǒng)中醫(yī)理論中無“腎纖維化”一名，但各種腎臟疾患進(jìn)行性發(fā)展都可表現(xiàn)為正虛邪實(shí)，變證由生，出現(xiàn)“水腫”“雇閉”，甚至“關(guān)格”，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對該疾病進(jìn)程的認(rèn)識是一致的[5]。許多中藥對腎纖維化都顯示了良好的效果，其具體的分子機(jī)制也逐漸有報道[6-9]。中藥單體或活性提取物往往因其低毒性、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)發(fā)揮臨床藥理作用。柚皮苷(naringin，NAR)存在于多種中草藥中，是一種具有多種生物學(xué)和藥理特性的黃酮類化合物，具有抗炎、抗癌活性，且對骨再生、代謝綜合征、氧化應(yīng)激、遺傳損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病均有影響。研究報道，柚皮苷具有抗肝纖維化、肺纖維化的作用[10-14]，還可通過多種途徑改善糖尿病腎病[15]，但對于腎纖維方面的作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證?；诖?，本研究擬通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探討柚皮苷對TGF-β誘導(dǎo)的腎纖維化模型的作用，為臨床上柚皮苷治療腎纖維化疾病提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞正常大鼠腎細(xì)胞(normal rat kidney，NRK)來源中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，目錄號：GNR 2。

1.2 藥物與試劑柚皮苷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：N107344)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司，批號：SH30022.01B)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號：10270-106)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)凍干粉、0.25%胰蛋白酶消化液、DNase/RNase-Free水、10 mmol dNTPs Mix、細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)、抗熒光衰減封片劑、Triton X-114試劑、牛血清白蛋白(albumin bovine serum，BSA)(北京索萊寶科技有限公司，批號：P1010、T1350、R1600、PC2200、CA1210、S2110、T8210、A8010)；TGF-β1試劑(美國PeproTech公司，批號：96-100-21-2)；Trizol試劑(美國Ambion公司，貨號：15596026)；SYBR FAST qPCR Master Mix試劑(美國Kapa Biosystems公司，批號：KM4101)；Oligo (dT)18 Primer、PrimeScript II Reverse Transcriptase、Recombinant RNase Inhibitor[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，批號：3806、2690A、2313A]；蛋白質(zhì)Marker(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，批號：J-SPR1300-15)；化學(xué)發(fā)光試劑(上海榕柏生物技術(shù)有限公司，批號：MFA5310)；結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)蛋白一抗、纖維連接蛋白(fibronectin1，F(xiàn)N1)蛋白一抗、羊抗兔蛋白二抗(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：PAB30609、PAB4587、SAB43742)；Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號：PAB4589、PAB36269)；引物序列由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.3 儀器DMIL LED型倒置熒光顯微鏡(德國Leica 公司)；Icen-24R型高速冷凍離心機(jī)、Nano-300型超微量分光光度計、AMR-100型酶標(biāo)儀(杭州奧盛儀器有限公司)；GE48527型PCR儀(杭州柏恒科技有限公司)；CFX-Connect 96型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；C2型激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)；JP-K900型全自動化學(xué)發(fā)光分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；H.SWX-600BS型水浴鍋(上海圣科儀器設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 NRK細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)將凍存的NRK細(xì)胞從液氮罐中取出后移至 37 ℃水浴中，使細(xì)胞迅速融化。待凍存液完全融化后，將細(xì)胞懸液吸至離心管中，加入4 mL 完全培養(yǎng)基，400 g離心3 min，棄上清，細(xì)胞重新懸浮于1 mL培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入4 mL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 NRK細(xì)胞腎纖維化模型構(gòu)建與鑒定收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2.5×105mL-1，接種于6孔板，每孔2 mL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常組、2 μg·L-1TGF-β1 組、5 μg·L-1TGF-β1組、10 μg·L-1TGF-β1組[16]。正常組采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余組分別采用含終濃度為2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1TGF-β1的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。24 h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，用Trizol試劑裂解細(xì)胞，抽提總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再按照SYBR FAST qPCR Master Mix試劑說明書進(jìn)行RT-PCR檢測，根據(jù)α-SMA的轉(zhuǎn)錄水平確定TGF-β1的最佳誘導(dǎo)濃度。引物序列見表1。

表1 引物序列信息

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖活力收集NRK細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為3×104mL-1，接種于96孔板，每孔100 μL，置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。將細(xì)胞分為不同NAR濃度(0 μmol·L-1、0.5 μmol·L-1、1 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)組，每組3個復(fù)孔，繼續(xù)分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h[17]。培養(yǎng)結(jié)束后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于 450 nm 處測量各孔的吸光度值。

2.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)收集NRK細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2.5×105mL-1，接種于6孔板，每孔2 mL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。正常組采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型細(xì)胞采用含TGF-β1(2.2項(xiàng)下篩選出的最佳濃度)的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后分為TGF-β1組和TGF-β1+1 μmol·L-1NAR組、TGF-β1+10 μmol·L-1NAR組、TGF-β1+40 μmol·L-1NAR組，TGF-β1組細(xì)胞采用含上述濃度TGF-β1的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；TGF-β1+1 μmol·L-1NAR組、TGF-β1+10 μmol·L-1NAR組、TGF-β1+40 μmol·L-1NAR組分別用含1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、40 μmol·L-1NAR的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，48 h后利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.5 免疫熒光法檢測CTGF、FN1的表達(dá)細(xì)胞分組與培養(yǎng)同2.4項(xiàng)，使用12孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。用PBS清洗細(xì)胞后加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定30 min；采用1 mL 0.5%Triton X-100室溫通透20 min；加入1 mL 5%BSA，37 ℃封閉1 h，棄封閉液；分別加入300 μL PBS稀釋后的CTGF蛋白一抗、FN1蛋白一抗(稀釋比例均為1200)，4 ℃孵育過夜；棄一抗，加入300 μL PBS稀釋后的二抗(稀釋比例為1200)，37 ℃孵育1 h；用1 mL PBS洗滌2次后加入300 μL抗熒光淬滅封片液(含DAPI)，用熒光顯微鏡觀察并拍照。使用Image J軟件獲取照片相關(guān)數(shù)據(jù)，根據(jù)平均光密度評估蛋白相對表達(dá)量。

2.6 Western Blot檢測Collagen I的表達(dá)細(xì)胞分組與培養(yǎng)同2.4項(xiàng)。收集各組細(xì)胞，適量預(yù)冷的1×PBS洗滌2 次，按照每1×106個細(xì)胞加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液 200 μL，4 ℃充分裂解細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，95 ℃以上加熱 10 min，12 000×g離心 10 min，取上清，測定蛋白含量，根據(jù)蛋白含量加入5×緩沖上樣液和 PBS，在100 ℃水浴鍋中煮沸5 min，待樣品冷卻后分離目標(biāo)蛋白并轉(zhuǎn)膜，再用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，4 ℃過夜孵育一抗后，進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG抗體孵育。將膜放置在暗室中，取ECL發(fā)光液加在膜的正面與之充分接觸，將膜置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測，每組重復(fù)3次。通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。將各灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 TGF-β1對NRK細(xì)胞中α-SMAmRNA表達(dá)水平的影響與正常組相比，2 μg·L-1TGF-β1組、5 μg·L-1TGF-β1組和10 μg·L-1TGF-β1組NRK細(xì)胞中α-SMAmRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，其中5 μg·L-1TGF-β1組α-SMAmRNA表達(dá)水平明顯最高，因此，選擇5 μg·L-1TGF-β1作為本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷淖罴颜T導(dǎo)濃度。見表2。

表2 TGF-β1對NRK細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)水平的影響

3.2 柚皮苷干預(yù)NRK的最佳干預(yù)濃度和時間與24 h比較，除0 μmol·L-1組和0.5 μmol·L-1組外，其余濃度組細(xì)胞干預(yù)72 h后，抑制率顯著升高(P<0.05)；0.5 μmol·L-1組和1 μmol·L-1組細(xì)胞干預(yù)48 h后，抑制率顯著降低(P<0.05)。與 48 h 比較，1 μmol·L-1組、5 μmol·L-1組、10 μmol·L-1組、 20 μmol·L-1組和40 μmol·L-1組NRK細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，抑制率顯著升高(P<0.05)。不同濃度NAR(0、0.5、1、5、10、20、40 μmol·L-1)干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化NRK細(xì)胞24、48、72 h后，CCK-8檢測結(jié)果顯示：與 0 μmol·L-1組比較，處理24 h后，10 μmol·L-1、20 μmol·L-1和40 μmol·L-1濃度組對纖維化NRK細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用；處理48 h后，除了0.5 μmol·L-1濃度組外，其余濃度組的平均抑制率均明顯上升，且呈劑量依賴性；處理72 h后，各濃度組的平均抑制率均明顯上升，且呈劑量依賴性。有研究表明，40 μmol·L-1NAR處理72 h對正常大鼠NRK腎細(xì)胞產(chǎn)生毒性[17]，因此，設(shè)置后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度為1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、40 μmol·L-1，干預(yù)時間為48 h。見表3，圖1。

表3 NAR對NRK細(xì)胞增殖抑制率影響

圖1 不同濃度的NAR作用于纖維化NRK細(xì)胞平均抑制率的影響

3.3 柚皮苷對NRK細(xì)胞形態(tài)的影響正常組NRK細(xì)胞為長梭形，貼壁生長。TGF-β1組NRK細(xì)胞形態(tài)開始由梭形、不規(guī)則多邊形變得狹長，出現(xiàn)細(xì)胞纖維化。經(jīng)不同濃度NAR干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)由狹長變?yōu)樗笮?，?xì)胞纖維化減弱。見圖2。

注：1：正常組；2：TGF-β1組；3：TGF-β1+1 μmol·L-1NAR組；4：TGF-β1+10 μmol·L-1NAR組；5：TGF-β1+40 μmol·L-1NAR組圖2 各組NRK腎細(xì)胞的形態(tài)變化(×100)

3.4 柚皮苷對NRK細(xì)胞內(nèi)CTGF及FN1蛋白表達(dá)水平的影響與正常組相比，TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)CTGF及FN1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與TGF-β1組相比，TGF-β1+NAR(1 μmol·L-1)組、TGF-β1+NAR(10 μmol·L-1)組及TGF-β1+NAR(40 μmol·L-1)細(xì)胞CTGF及FN1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 柚皮苷對NRK細(xì)胞內(nèi)CTGF及FN1蛋白表達(dá)水平的影響

3.5 柚皮苷對NRK細(xì)胞內(nèi)Collagen I蛋白表達(dá)水平的影響與正常組相比，TGF-β1組CollagenI表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與TGF-β1組比較，TGF-β1+NAR(1 μmol·L-1)組、TGF-β1+NAR(10 μmol·L-1)組、TGF-β1+NAR(40 μmol·L-1)組CollagenI表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見表5和圖4。

表5 柚皮苷對NRK細(xì)胞內(nèi)Collagen I蛋白表達(dá)水平的影響

注：1：正常組；2：TGF-β1組；3：TGF-β1+1 μmol·L-1NAR組；4：TGF-β1+10 μmol·L-1NAR組；5：TGF-β1+40 μmol·L-1 NAR組圖4 不同組NRK細(xì)胞內(nèi)CollagenI表達(dá)的影響

4 討論

腎臟作為人體重要的代謝器官之一，可以通過排除代謝物調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。腎纖維化幾乎是所有慢性和進(jìn)展性腎病的共同階段，其最終結(jié)局會導(dǎo)致臟器硬化發(fā)生腎衰竭，喪失代謝功能[18]。在腎病發(fā)展的過程當(dāng)中，雖然腎損傷后纖維基質(zhì)的沉積最初可能有助于組織修復(fù)，但是腎實(shí)質(zhì)內(nèi)瘢痕的堆積會造成腎臟組織發(fā)生纖維化，降低組織修復(fù)能力[19]。中醫(yī)認(rèn)為，腎臟實(shí)質(zhì)硬化形成瘢痕而喪失正常功能屬于正氣衰敗，濁毒實(shí)邪壅滯[20]。研究發(fā)現(xiàn)，在腎纖維化過程中，TGF-β1是最有效的成纖維因子，可刺激腎成纖維細(xì)胞的活化、增殖和腎纖維化[16]。本實(shí)驗(yàn)通過TGF-β1誘導(dǎo)大鼠NRK細(xì)胞構(gòu)建腎纖維化細(xì)胞模型。同時發(fā)現(xiàn)，α-SMA在病變腎臟活化的成纖維細(xì)胞中表達(dá)升高[21]，因此本實(shí)驗(yàn)通過測定α-SMA的轉(zhuǎn)錄水平來鑒定細(xì)胞是否纖維化。結(jié)果顯示，與正常組相比，大鼠NRK腎細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，α-SMA的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，TGF-β1誘導(dǎo)大鼠NRK細(xì)胞構(gòu)建腎纖維化細(xì)胞模型建立成功。

隨著人們對中藥了解的深入，中藥的毒性和安全性備受關(guān)注[22]。腎臟在代謝產(chǎn)物的排泄、酸堿平衡、維持體內(nèi)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，腎小管的分泌和重吸收功能主要由轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)，而諸多中藥成分能夠影響轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)或功能，從而改變藥物在腎臟的分布，致使有毒物質(zhì)蓄積，最終引發(fā)腎毒性[23]。而在本實(shí)驗(yàn)中，柚皮苷作用于正常細(xì)胞后，只有 40 μmol·L-1組NRK細(xì)胞處理72 h后，其抑制率升高，表明柚皮苷在較高劑量、較長時間的作用下對大鼠NRK細(xì)胞的生長具有抑制作用，在較低劑量處理下沒有明顯的生物毒性。

中醫(yī)認(rèn)為，腎病屬本虛標(biāo)實(shí)，其病機(jī)為各種慢性疾病日久不愈，而飲食不節(jié)、情志過極、外邪侵襲等可加重癥狀，導(dǎo)致毒、瘀、邪、濕等聚集并阻塞經(jīng)絡(luò)，損傷臟腑，造成脾腎虛損[24]。腎主水，主一身之水液的運(yùn)行布散。腎氣虧虛則會造成水液運(yùn)化失常，水濕積聚成痰造成氣血運(yùn)行不暢。而脾臟虧虛無力推動則會導(dǎo)致水濕和瘀血停聚成濁毒[25]。治法應(yīng)以溫補(bǔ)腎陽、化氣利水為主[24]。骨碎補(bǔ)作為臨床上常用中藥，歸肝、腎經(jīng)，性溫，味辛、苦，具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨功效，常用于治療腎虛腰痛，柚皮苷便是其主要活性成分[26]。在心肌和肝臟中的應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可減少心肌間質(zhì)中Collagen Ⅰ和FN合成與沉積[13]，且對于纖維化的肝臟有保護(hù)作用[14]。CTGF已被證明是TGF-β促纖維化作用的下游介質(zhì)[27]，而纖連蛋白1參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程并在諸如纖維化等疾病中起作用[28]。在腎纖維化細(xì)胞中，Ⅰ型膠原蛋白是最豐富的基質(zhì)蛋白，同時也會積累其他膠原，包括Ⅲ型、Ⅴ型、Ⅶ型和ⅩⅤ型，以及黏附性糖蛋白纖維連接蛋白[29]。本研究顯示，在經(jīng)過TGF-β1誘導(dǎo)后，NRK大鼠腎細(xì)胞內(nèi)CTGF、FN1和Collagen Ⅰ表達(dá)明顯增加，而經(jīng)柚皮苷干預(yù)后，CTGF、FN1和Collagen Ⅰ表達(dá)隨著柚皮苷濃度的升高呈現(xiàn)降低趨勢，表明柚皮苷可以降低由TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)CTGF、FN1蛋白及Collagen Ⅰ的表達(dá)。和先前關(guān)于通過抑制CTGF來改善腹膜纖維化[30]及通過靶向調(diào)節(jié)FN1改善膀胱纖維化[31]的結(jié)果相似。

綜上所述，柚皮苷可通過抑制CTGF、FN1和Collagen Ⅰ蛋白的表達(dá)來抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎纖維化。