宋志文 馬陽(yáng)光 左曉霜 王選康 胡學(xué)昱 王哲

脊髓損傷常導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重時(shí)可造成癱瘓，給病人及其家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)［1-2］。脊髓損傷根據(jù)病理過程可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)階段［1］。原發(fā)性損傷是指外力（如壓縮、挫傷和剪切力等）直接作用于脊髓所造成的損傷，通常是不可逆的。繼發(fā)性損傷由原發(fā)性損傷發(fā)展而來(lái)，其病理過程主要包括炎癥反應(yīng)、氧自由基形成、局部缺血和凋亡性壞死，可持續(xù)數(shù)周或數(shù)月，導(dǎo)致病灶面積逐漸擴(kuò)大，進(jìn)一步加重神經(jīng)損傷［3］。其中，繼發(fā)性炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是影響脊髓損傷預(yù)后的關(guān)鍵［4-5］。炎癥因子是繼發(fā)性炎癥反應(yīng)的主要介導(dǎo)者［6］。脊髓損傷后神經(jīng)元發(fā)生不可逆性壞死，神經(jīng)元功能喪失使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)中斷，最終導(dǎo)致感覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙。有證據(jù)表明，抑制炎癥因子表達(dá)可以調(diào)節(jié)損傷局部的炎癥微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)元再生［7］。

光生物調(diào)節(jié)（photobiomodulation，PBM）具有緩解疼痛、減輕炎癥以及促進(jìn)受損細(xì)胞和組織修復(fù)的作用［8］。目前，PBM 已廣泛應(yīng)用于糖尿病、創(chuàng)面愈合、顳下頜關(guān)節(jié)紊亂、周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療［9-12］。鑒于PBM在抑制炎癥和免疫調(diào)節(jié)中的作用，近年來(lái)有越來(lái)越多的學(xué)者將其應(yīng)用于脊髓損傷的治療領(lǐng)域。將808 nm 近紅外光經(jīng)皮投射到脊髓損傷區(qū)，可有效促進(jìn)脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)［13-14］。但經(jīng)皮照射存在能量損耗過大，到達(dá)損傷區(qū)能量不確切且波動(dòng)較大的問題，一定程度上限制了PBM在脊髓損傷治療領(lǐng)域的應(yīng)用［15-16］。因此，我們課題組研發(fā)了一種可體內(nèi)埋置的生物醫(yī)學(xué)光纖，并在仔豬體內(nèi)對(duì)其生物安全性進(jìn)行了驗(yàn)證［17-18］。

本研究將體內(nèi)可埋置的生物醫(yī)學(xué)光纖應(yīng)用于小鼠脊髓鉗夾損傷模型中，研究體內(nèi)埋置光纖介導(dǎo)的光生物調(diào)節(jié)對(duì)脊髓損傷小鼠組織修復(fù)和功能恢復(fù)的影響，以期為PBM治療脊髓損傷的臨床應(yīng)用提供新思路。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液、5 μL熒光染料（艾科瑞，中國(guó)）；白細(xì)胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，中國(guó)）；一抗：微管關(guān)聯(lián)蛋白2（microtubule associated protein 2，MAP2）（Cell Singnaling Technology，8707S，美國(guó)），神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclei，NeuN）（Abcam，ab177487，英國(guó)）；熒光二抗：紅色熒光驢抗兔（Jackson，152432，美國(guó)），綠色熒光山羊抗兔（Jackson，156194，美國(guó)）；原位末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒（C1090，碧云天，中國(guó)）；可埋置生物醫(yī)學(xué)光纖（西安雅澤泰克醫(yī)療科技有限公司，中國(guó)）；激光裝置（MW-GX-808，長(zhǎng)春鐳仕光電有限公司，中國(guó)）；熒光顯微鏡（BX51，奧林巴斯，日本）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性健康清潔級(jí)C57BL/6 小鼠27 只，質(zhì)量為20～25 g，6～8 周齡，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫22 ℃～25 ℃，濕度45%～65%，規(guī)律晝夜節(jié)律，自由攝食水、飼料。構(gòu)建小鼠T9節(jié)段鉗夾損傷及光生物調(diào)節(jié)治療模型，將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組、脊髓損傷（SCI）組、光生物調(diào)節(jié)治療（SCI+PBM）組，每組9只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IACUC-20220402）。

（二）模型制備

建立小鼠雙側(cè)脊髓鉗夾損傷模型［14，19］，通過腹腔注射0.6%戊巴比妥鈉（10 mL/kg）麻醉小鼠。先用聚維酮碘將小鼠皮膚消毒3遍（T9為中心，C7～L5），再用酒精消毒后，將皮膚、皮下組織和椎旁肌肉逐層分離，在顯微鏡下定位T9椎體，用纖維咬合鉗切除T9節(jié)段椎板，使脊髓充分顯露。在Dumont系結(jié)鑷之間添加金屬墊片，使鉗夾閉合時(shí)有0.3 mm 的間隙，將改良的Dumont系結(jié)鑷于T9節(jié)段位置，垂直插入脊髓兩側(cè)，并鉗夾30 s，可見小鼠雙下肢伸直，尾巴抽動(dòng)現(xiàn)象，脊髓硬脊膜下顯現(xiàn)淤紫色鉗夾印記。用可吸收縫線將生物醫(yī)學(xué)光纖的前端適度固定在T8節(jié)段的椎體和軟組織上，逐層縫合肌肉和皮膚，最后用聚維酮碘消毒傷口皮膚，將光纖的后端與激光照射裝置連接。光纖表面高度透明的醫(yī)用二氧化硅涂層在確保柔韌性和生物相容性的同時(shí)也不影響其光學(xué)性能。光纖為圓柱形，直徑為600 mm，我們使用經(jīng)過校準(zhǔn)的光學(xué)傳感器測(cè)試光纖的輸出功率，確保光纖的輸出功率與設(shè)定的功率一致，每天以808 nm、50 mW/cm2定時(shí)光照損傷區(qū)50 min，連續(xù)照射14 d。每天兩次輔助性排尿避免小鼠尿潴留，直至恢復(fù)自主排尿。Sham組僅暴露脊髓組織，無(wú)鉗夾損傷。小鼠T9節(jié)段脊髓鉗夾損傷及體內(nèi)光生物調(diào)節(jié)治療模型見圖1。

圖1 小鼠雙側(cè)脊髓鉗夾損傷模型構(gòu)建示意圖 a、b：脊髓損傷鉗夾模型構(gòu)建；c、d：體內(nèi)光生物調(diào)節(jié)模型構(gòu)建

（三）實(shí)時(shí)熒光定量PCR

造模14 d后使用生理鹽水灌注小鼠，剝離1 cm長(zhǎng)的脊髓損傷中心節(jié)段，使用Trizol 法提取組織mRNA，反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件為37 ℃15 min、85 ℃5 s、4 ℃10 min。根據(jù)試劑盒說明書，在含有2 μL cDNA、2 μL 雙蒸水、1 μL 引物和5 μL 熒光染料的10 μL 溶液中進(jìn)行qPCR。所用引物序列見表1。以β-Actin 作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCT方法分析qPCR數(shù)據(jù)。

表1 引物序列

（四）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

造模14 d后用生理鹽水灌注小鼠，剝離1 cm長(zhǎng)的脊髓損傷中心節(jié)段，脊髓節(jié)段在磷酸鹽緩沖液（PBS）中勻漿，收集組織勻漿上清液并根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)操作，使用酶標(biāo)儀分析上清液中炎癥因子的表達(dá)水平。

（五）冰凍切片

造模14 d后用4%多聚甲醛灌注小鼠，解剖1 cm長(zhǎng)的脊髓損傷中心部位，多聚甲醛固定24～48 h，4 ℃下25%蔗糖溶液脫水直到組織沉沒，OCT 包埋劑快速冷凍包埋組織，并延脊髓中心矢狀位方向進(jìn)行組織切片，切片厚度為10 μm。

（六）免疫熒光染色

PBS沖洗冰凍切片15 min，0.3%Triton X-100室溫打孔20 min，PBS 沖洗組織切片。室溫下用10%山羊血清孵育組織切片1 h。去除血清，滴加MAP2一抗（1∶200）4 ℃下孵育過夜。PBS 沖洗組織切片，滴加紅色熒光抗兔二抗（1∶200）室溫下孵育1 h。去除二抗，PBS沖洗組織切片，用含有4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的封片劑封片。熒光顯微鏡拍攝熒光圖像。每組切片在損傷區(qū)分別采集3張圖片，用于統(tǒng)計(jì)分析。

（七）TUNEL染色

滴加NeuN一抗方法同MAP2（1∶200），按照TUNEL試劑盒說明書，配TUNEL檢測(cè)工作液與熒光二抗（1∶200）混合后，37 ℃孵育1 h，封片采集圖片。

（八）運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估

采用巴索小鼠量表（Basso mouse scale，BMS）評(píng)分評(píng)估小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)［20］。在手術(shù)前和損傷后第1天、第3天、第7天、第14天測(cè)量評(píng)估。由兩名不知情的觀察者獨(dú)立評(píng)分每只動(dòng)物，0 分表示后肢完全癱瘓，9分表示后肢運(yùn)動(dòng)完全正常，取兩名觀察者評(píng)分的平均值作為最終得分。足印記法是將小鼠的前肢染上無(wú)毒無(wú)刺激性的藍(lán)色墨水，后肢染上紅色墨水，讓小鼠穿過一條鋪有A4 紙的直線跑道，觀察小鼠的步長(zhǎng)。

（九）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3 次，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），并通過GraphPad Prism 8 軟件（GraphPad，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用單因素方差分析和Bonferroni 事后檢驗(yàn)來(lái)分析特定時(shí)間點(diǎn)的組間差異。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PBM減輕小鼠脊髓損傷區(qū)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)

小鼠脊髓損傷14 d后，與Sham組比較，SCI組小鼠損傷區(qū)三種炎癥因子IL-1α、IL-1β、TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。另一方面，與SCI組比較，SCI+PBM 組的IL-1β和TNF-α表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與SCI 組比較，SCI+PBM 組IL-1α表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖2。

圖2 PBM 對(duì)損傷后炎癥因子的影響 a～c：qPCR 檢測(cè)炎癥因子mRNA 的相對(duì)水平；d～f：ELISA 檢測(cè)炎癥因子的蛋白濃度（*P＜0.01，#P＜0.001）

二、PBM促進(jìn)小鼠脊髓損傷后神經(jīng)元存活

小鼠脊髓損傷14 d后，與SCI組比較，Sham組和SCI+PBM 組的總凋亡百分比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。PBM 照射后，與SCI 組神經(jīng)元凋亡百分比（72.23%±1.83%）比較，Sham 組和SCI+PBM組的神經(jīng)元凋亡百分比（1.33%±0.47%，46.9%±2.41%）顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。綜上，與SCI 組比較，SCI+PBM 組神經(jīng)元凋亡減少，神經(jīng)元存活增多。見圖3。

圖3 PBM對(duì)神經(jīng)元的影響 a：組織免疫熒光染色結(jié)果；b、c：總凋亡和神經(jīng)元凋亡柱狀統(tǒng)計(jì)圖（*P＜0.001）

三、PBM促進(jìn)小鼠脊髓損傷后軸突再生

低倍鏡下觀察到，小鼠脊髓損傷14 d 后，與Sham 組比較，SCI 組MAP2 的神經(jīng)元軸突到損傷中心的距離明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與SCI組比較，SCI+PBM組MAP2的神經(jīng)元軸突到損傷中心的距離明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。兩組比較結(jié)果表明PBM 可以促進(jìn)小鼠脊髓損傷區(qū)神經(jīng)元軸突的再生。見圖4。

圖4 PBM對(duì)軸突延伸的影響 a：組織免疫熒光染色結(jié)果；b：軸突延伸情況柱狀統(tǒng)計(jì)圖（*P＜0.001）

四、PBM促進(jìn)脊髓損傷小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)

造模1 d 后SCI 組和SCI+PBM 組BMS 評(píng)分為0分，表示造模成功。損傷后1～7 d BMS評(píng)分升高，表明小鼠癱瘓程度逐漸恢復(fù)，但兩組評(píng)分的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。損傷后7～14 d BMS 評(píng)分繼續(xù)升高，14 d 時(shí)，SCI 組評(píng)分為（2.8±0.4）分，SCI+PBM組評(píng)分為（5.2±0.75）分，兩組之間評(píng)分的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。足印記圖像顯示損傷14 d 后SCI組小鼠雙后肢足背觸地，前后肢不協(xié)調(diào)，軀干穩(wěn)定性差，后肢拖行前進(jìn)，步長(zhǎng)較Sham 組相比明顯縮短（P＜0.001）。經(jīng)過14 d 光照后，SCI+PBM 組足底觸地，前后肢協(xié)調(diào)，軀干穩(wěn)定性好，運(yùn)動(dòng)功能明顯改善，步長(zhǎng)與SCI組相比明顯增大（P＜0.01）。見圖5。

圖5 PBM 對(duì)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響 a：足印記結(jié)果；b：足印記步長(zhǎng)柱狀統(tǒng)計(jì)圖（SCI 組與Sham 組比較，#P＜0.001；SCI+PBM 組與SCI 組比較，*P＜0.01）；c：BMS評(píng)分評(píng)估運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況（與SCI組比較，*P＜0.01）

討 論

脊髓損傷是最具破壞性的創(chuàng)傷性疾病之一，且目前尚無(wú)有效的治療手段。脊髓損傷發(fā)生后，機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，伴隨而來(lái)的繼發(fā)性炎癥等，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死［21］。其中，控制繼發(fā)性炎癥對(duì)于修復(fù)脊髓損傷至關(guān)重要。本文采用改良后的脊髓損傷鉗夾模型，該模型操作簡(jiǎn)便且可保持硬脊膜的完整性，并與人類脊髓損傷的生物力學(xué)和病理生理過程十分相似，適合作為研究脊髓損傷后的神經(jīng)功能和病理生理變化的模型。既往研究發(fā)現(xiàn)，PBM可以使大鼠脊髓損傷區(qū)巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞向促修復(fù)的M2型極化，從而促進(jìn)損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)［14］。上述研究采用經(jīng)皮照射的方式進(jìn)行治療，從而導(dǎo)致脊髓表面能量水平低下，大大降低了治療效果。特別對(duì)于深部脊髓組織，提高能量利用率對(duì)PBM治療的成效至關(guān)重要。PBM經(jīng)皮照射病變部位后，只有小劑量的能量（約6%）能夠穿透組織到達(dá)脊髓表面［15-16］。經(jīng)皮照射的低傳輸率嚴(yán)重限制了PBM治療在脊髓損傷中的臨床應(yīng)用。本研究應(yīng)用的體內(nèi)埋置光纖，可將光能直接投射到脊髓表面，便于發(fā)揮更好的治療效果。在仔豬體內(nèi)對(duì)光纖的生物安全性進(jìn)行驗(yàn)證，光纖植入部位并未出現(xiàn)組織壞死和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷，具有安全性和可行性［17-18］。本研究以治療小鼠脊髓損傷為出發(fā)點(diǎn)，探究體內(nèi)埋置光纖介導(dǎo)的光生物調(diào)節(jié)對(duì)脊髓損傷后小鼠組織修復(fù)和功能恢復(fù)的影響。

已有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后多種炎癥因子的含量發(fā)生明顯改變，如IL-1α、IL-1β和TNF-α等［22］，提示這些炎癥因子參與脊髓損傷病理過程，并在脊髓損傷的炎癥反應(yīng)中起重要作用［23-24］。先前研究發(fā)現(xiàn)，PBM經(jīng)皮照射可抑制大鼠脊髓損傷區(qū)神經(jīng)毒性的M1 型巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞極化，并減少損傷區(qū)炎癥因子TNF-α的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)［13-14］。本研究qPCR和ELISA結(jié)果表明，在小鼠脊髓損傷后14 d，PBM通過減少IL-1α、IL-1β和TNF-α的表達(dá)，改善損傷區(qū)炎癥微環(huán)境，有助于小鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

隨著脊髓損傷的深入研究，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和軸突再生成為治療脊髓損傷的重點(diǎn)。有研究報(bào)道，在大鼠脊髓損傷模型中，經(jīng)PBM 照射后，細(xì)胞總凋亡數(shù)量減少而神經(jīng)元存活數(shù)量增多［25］。本研究采用小鼠脊髓損傷模型，NeuN-TUNEL 染色結(jié)果表明PBM可以減少脊髓損傷區(qū)神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元存活。MAP2主要在神經(jīng)元胞體、樹突和軸突中表達(dá)，它能增加微管的穩(wěn)定性、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育，對(duì)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)的重建和延伸具有重要作用［26］。本研究采用體內(nèi)埋置光纖照射方式觀察PBM 對(duì)損傷區(qū)神經(jīng)元的影響。MAP2 及NeuN-TUNEL 染色結(jié)果提示，PBM可以直接促進(jìn)神經(jīng)元存活和軸突再生。在脊髓損傷后14 d，SCI+PBM 組BMS 評(píng)分與SCI 組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明SCI+PBM組小鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)更好。足印記結(jié)果也表明SCI+PBM 組小鼠的后肢功能有明顯改善。綜上，本研究結(jié)果表明在體內(nèi)埋置光纖介導(dǎo)的光生物調(diào)節(jié)作用下，減輕了損傷區(qū)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)及神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)了神經(jīng)元存活及軸突再生，有助于損傷后小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

本研究證明了體內(nèi)埋置光纖介導(dǎo)的光生物調(diào)節(jié)可促進(jìn)小鼠脊髓損傷后組織修復(fù)和功能恢復(fù)，但仍存在以下局限性：本研究在體觀察了PBM對(duì)神經(jīng)元的影響，但PBM 是直接作用于損傷區(qū)神經(jīng)元，還是通過調(diào)控?fù)p傷區(qū)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)間接影響神經(jīng)元存活，尚不完全清楚，且相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。綜上所述，本文對(duì)脊髓損傷后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)和功能恢復(fù)進(jìn)行研究，表明體內(nèi)埋置光纖介導(dǎo)的光生物調(diào)節(jié)可抑制損傷區(qū)IL-1α、IL-1β和TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元存活和軸突再生，為可植入式生物醫(yī)學(xué)光纖的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。