亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        鞍帶石斑魚Epinephelus lanceolatus卵子的短期保存*

        2022-10-13 09:51:44魏千皓葉智鋒王崇偉林浩然李水生張勇
        關(guān)鍵詞:血清

        魏千皓,葉智鋒,王崇偉,林浩然,李水生,張勇

        有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510275

        鞍帶石斑魚Epinephelus lanceolatus隸屬鱸形目,鮨科,石斑魚屬,主要分布于印度-太平洋地區(qū),是大型的珊瑚礁魚類。目前報(bào)道最大的鞍帶石斑魚個(gè)體長達(dá)2.7 m,體質(zhì)量可達(dá)400 kg[1]。鞍帶石斑魚生長速度快,味道鮮美,是我國和東南亞國家重要的海水養(yǎng)殖魚類。然而,鞍帶石斑魚人工繁殖難度大,受精卵價(jià)格昂貴。近年來,每公斤受精卵的價(jià)格在3 萬~6 萬元之間,仍供不應(yīng)求。鞍帶石斑魚的卵子主要通過激素催產(chǎn)獲得,其活力在接觸海水后迅速下降,從而導(dǎo)致受精失敗。配子保存是提高魚類人工繁育效率的有效策略。目前,鞍帶石斑魚精子的長期保存研究已經(jīng)開展[2-3]。冷凍保存后的精子已應(yīng)用于不同石斑魚的種間雜交[4-5]。但是,鞍帶石斑魚卵子保存的研究尚未見報(bào)道。

        由于魚類卵子的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,很難像精子一樣進(jìn)行長期保存,相較而言,短期的體外保存是可行的途徑。在金魚、鯉魚、虹鱒、小體鱘和梭鱸等魚類中,已經(jīng)開展了卵子的短期保存研究[6-11],發(fā)現(xiàn)體外保存的卵子在數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)仍能保持較高的活力。對于生產(chǎn)和科研工作來說,短期內(nèi)保持卵子活力有助于人工授精和孵化管理,可提高人工繁育的效率。為了保持鞍帶石斑魚卵子的活力和延長體外保存的時(shí)間,本研究對卵子體外保存的條件進(jìn)行研究,建立適用于鞍帶石斑魚卵子體外保存的方法。

        1 材料和實(shí)驗(yàn)

        1.1 配子收集

        鞍帶石斑魚的卵子采集于海南晨海水產(chǎn)有限公司感城養(yǎng)殖基地。于2020 年6~10 月,選擇處于生殖季節(jié)、腹部隆起、生殖孔紅腫凸起的鞍帶石斑魚親魚(10~12 齡,體質(zhì)量60~70 kg),在人工催產(chǎn)后,通過擠壓腹部使精子或卵子流出。將精液收集于50 mL 離心管中,然后4 ℃儲存直至使用。將卵子收集于干燥潔凈的500 mL玻璃燒杯中,然后分別放置于塑料培養(yǎng)皿中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        1.2 受精實(shí)驗(yàn)

        將精子和卵子置于燒杯中輕輕混合,然后加入過濾海水激活精子與卵子。3 min 后,用干凈的海水清洗受精卵兩次,然后轉(zhuǎn)移至裝有10 L 的海水塑料桶中。在培育的過程中,保持充氣。培育4 h 后,待受精卵發(fā)育至囊胚期,在解剖顯微鏡下觀察,計(jì)算受精率[(受精率=(受精卵總數(shù)/卵子總數(shù))×100%,n=1 000顆]。培育20 h后,在解剖顯微鏡下觀察,計(jì)算孵化率[孵化率=(孵化幼魚總數(shù)/卵子總數(shù))×100%,n=1 000顆)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        以逐步進(jìn)行的方式設(shè)計(jì)了6個(gè)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)卵子總數(shù)為n=1 000顆。

        1.3.1 卵子保存培養(yǎng)基的確定 以無酚紅的Leibovitz's L-15(L-15)培養(yǎng)基、Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)培養(yǎng)基、 Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI-1640)培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)保存液。以上培養(yǎng)基購買于武漢普諾賽生命科技有限公司。卵子和培養(yǎng)基大約按1∶6 的比例混合,28 ℃放置2 h,然后檢測卵子的受精率與孵化率。

        1.3.2 保存溫度的測定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)1 的結(jié)果,將卵子置于L-15 培養(yǎng)基中,在不同溫度(16、22、28和32 ℃)下保存2 h,然后檢測卵子的受精率與孵化率。

        1.3.3 培養(yǎng)基pH 值的測定 為了確定卵子保存的最佳培養(yǎng)基pH 值,根據(jù)實(shí)驗(yàn)1 和2 的結(jié)果,將卵子分別放置在pH 值為7.4、7.8、8.1、8.5的L-15 培養(yǎng)基中。2 h 后,檢測卵子的受精率與孵化率。

        1.3.4 保存時(shí)間對卵子活力的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)1、2 和3 的結(jié)果,將卵子保存在22 ℃的L-15 培養(yǎng)基(pH=8.1)中,分別在不同的保存時(shí)間(0、1、2、4 和6 h)后檢測卵子的受精卵與孵化率。

        1.3.5 不同血清對卵子活力的影響 為了延長卵子保存的時(shí)間,將不同劑量的胎牛血清(FBS,fetal bovine serum)和鞍帶石斑魚血清(GGS,giant grouper serum)分別添加進(jìn)L-15 培養(yǎng)基(pH=8.1)中。然后,將卵子置于含有血清的L-15 培養(yǎng)基中,22 ℃保存4 h,檢測卵子的受精卵與孵化率。鞍帶石斑魚血液樣品采集于處在繁殖季節(jié)的親魚,4 ℃以8 000×g速度離心15 min,分離血清樣品,放置-80 ℃冰箱儲存。

        1.3.6 維生素預(yù)混料對卵子活力的影響 基于上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,為了進(jìn)一步延長卵子保存的時(shí)間,將20 mg/L 維生素預(yù)混料(廈門惠盈動物科技有限公司)添加入含有0.1 μL/mL鞍帶石斑魚血清的L-15 培養(yǎng)基(pH=8.1)中。然后,將卵子置于添加維生素的培養(yǎng)基中,22 ℃時(shí)分別在0、2 、4 、6和8 h后檢測卵子的受精率和孵化率。

        1.4 統(tǒng)計(jì)分析

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 23.0(SPSS,Chicago,IL,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±S.E.M.。百分比數(shù)據(jù)在反正弦變換后進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)各組之間差異性,利用Fisher的最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行多重比較,取P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 卵子短期保存條件的優(yōu)化

        剛擠出來的卵子,不經(jīng)過保存立即授精,其受精率和孵化率分別為(75.6±5.31)%和(59.7±6.92)%(表1)。而未受精的卵子在28 ℃下直接暴露于空氣中2 h,則完全失去活力。在28 ℃下,卵子在不同培養(yǎng)基中保存2 h 后,活力出現(xiàn)了顯著下降,受精率均低于50%(表1)。與在其他培養(yǎng)基中保存的卵子相比,在L-15 培養(yǎng)基中保存的卵子具有相對較高的受精率[(44.2±0.73)%]和較高的孵化率[(25.4±2.42)%](表1);表明L-15 培養(yǎng)基可能更適合作為卵子保存的培養(yǎng)液。在L-15 培養(yǎng)基中,保存溫度為16 ℃和22 ℃時(shí),卵子的受精率和孵化率明顯高于28 ℃和32 ℃保存的卵子(表2)。由于卵子22 °C 保存后的受精率和孵化率高于16 ℃保存后的受精率和孵化率,因此選擇22.0 ℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的保存溫度。隨著pH 從7.4 升高到8.1,受精率與孵化率有增加的趨勢,但是統(tǒng)計(jì)數(shù)值沒有顯著差異(表3)。然而,由表3 可知,在培養(yǎng)基pH=8.1 時(shí),保存后卵子的受精率和孵化率明顯高于在pH=8.4 時(shí)的受精率和孵化率?;谏鲜鼋Y(jié)果,組合優(yōu)化好的保存條件(22 ℃,pH=8.1 的L-15 培養(yǎng)基),對卵子體外保存的時(shí)間進(jìn)行測試,結(jié)果見圖1。圖1顯示,卵子在保存液中2 h后,其受精率和孵化率分別為(66.4±2.70)%和(47.9±1.28)%;4 h 后,分 別 降 至(45.6±2.05)%和(25.8±1.67)%;6 h 后,分別降至(25.3±1.67)%和(11.6±1.06)%。

        表1 鞍帶石斑魚卵子28 ℃時(shí)在不同培養(yǎng)基中保存2 h后的受精率和孵化率1)Table 1 Fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in different media at 28 ℃for 2 h

        表2 溫度對鞍帶石斑魚卵子在L-15培養(yǎng)基中保存2 h后的受精率和孵化率的影響1)Table 2 Effects of temperatures on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium for 2 h

        表3 鞍帶石斑魚卵子22 ℃時(shí)在不同pH值的L-15培養(yǎng)基中保存2 h后的受精率和孵化率1)Table 3 Effects of pH on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium at 22 ℃for 2 h

        2.2 添加劑對卵子短期保存的影響

        為了延長卵子保存時(shí)間,在L-15 培養(yǎng)基中分別添加FBS 和GSS。如表4 所示,當(dāng)添加FBS 時(shí),幾乎所有卵子都在保存4 h 后失去活力。而添加GSS 可以顯著提高卵子的活力。在含有0.1 μL/mL GGS的L-15培養(yǎng)基中,保存4 h后的卵子的受精率與孵化率分別為(67.6±2.88)%和(46.3±0.68)%(表4)。將20 mg/L 的維生素預(yù)混物添加進(jìn)含有0.1 μL/mL GGS 的L-15 培養(yǎng)基中,卵子保存的時(shí)間得到了明顯地提高。在保存8 h 后,卵子的受精率 和 孵 化 率 分 別 為(64.4±1.87)% 和(44.8±1.76)%,與4 h 和6 h 時(shí)的數(shù)值沒有顯著性差異,低于對照組(圖2)。

        圖2 22 ℃L-15培養(yǎng)基(pH=8.1)添加鞍帶石斑魚血清和維生素預(yù)混料后,卵子不同保存時(shí)間后的受精率和孵化率Fig.2 The fertilization and hatching rates of giant grouper eggs at different storage time points in L-15 medium(pH=8.1)with supplementation GGS and vitamin premix at 22 ℃

        表4 鞍帶石斑魚卵子22 ℃時(shí)在含不同血清的L-15培養(yǎng)基中保存4 h后的受精率和孵化率1)Table 4 Effects of sera supplementation on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium at 22 ℃for 4 h

        3 討 論

        3.1 卵子保存的基礎(chǔ)培養(yǎng)基探討

        本研究首先對鞍帶石斑魚卵子體外保存的培養(yǎng)液進(jìn)行探討。L-15、DMEM/F12、RPMI-1640 和DMEM 培養(yǎng)基常用于動物細(xì)胞培養(yǎng)。我們對這4種培養(yǎng)基進(jìn)行了測試,結(jié)果表明,卵子保存在L-15培養(yǎng)基中具有較高的受精率和孵化率(表1)。L-15是魚類卵母細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基,具有維持卵母細(xì)胞活力的功能[12-14]。我們先前的研究亦表明,在L-15 培養(yǎng)基中,斜帶石斑魚的卵泡經(jīng)類固醇激素誘導(dǎo)后可以發(fā)生生發(fā)泡破裂;卵母細(xì)胞可以正常恢復(fù)第一次減數(shù)分裂[15-16]。這些研究表明,L-15可用為石斑魚卵子保存的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

        3.2 溫度和pH對卵子保存的影響

        溫度是影響卵子保存效率的關(guān)鍵因素。不同魚類的卵子對保存溫度的要求有很大的差別。有研究推測,保存溫度可能與魚類棲息地的溫度有關(guān)。冷水性魚類的卵子比暖水性魚類的卵子更能耐受較低的保存溫度[8,17-18]。鞍帶石斑魚是一種熱帶魚類。在海南省,其繁殖最適水溫為28~32 ℃。我們的結(jié)果表明,當(dāng)保存溫度為16 ℃和22 ℃時(shí),卵子擁有較高的受精率和孵化率。因此,鞍帶石斑魚卵子保存的適合溫度為16 ~22 ℃。卵子保存的最適溫度低于養(yǎng)殖的最適溫度的現(xiàn)象在其他魚類中也被觀察到。例如,小體鱘親魚在15 ℃下養(yǎng)殖,但卵子保存的適合溫度在7~11 ℃[8]。克林雷氏鯰的卵母細(xì)胞保存溫度為15 ℃,但親魚繁殖的水溫為25 ℃[19]。目前,關(guān)于卵子保存溫度低于親本養(yǎng)殖溫度的原因仍然未知。我們推測較低的溫度可能會降低卵細(xì)胞內(nèi)的代謝活動,從而有助于維持卵子的活力。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),pH 值的變化也會影響體外保存的卵子的活力[10,20-21]。虹鱒卵子在pH=8.2 的培養(yǎng)基中保存3 d 后的受精率高于在pH=9 和pH=10 的培養(yǎng)基中[10]。我們的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)卵子保存在pH=8.5 的L-15 培養(yǎng)基中,其活力顯著降低,但在pH 為7.4、7.8 和8.1 的培養(yǎng)基中,卵子的受精率和孵化率差異不顯著(表3)。由于pH 為8.1 時(shí),保存后卵子的受精率和孵化率最高,因此建議鞍帶石斑魚卵子保存在pH=8.1 的培養(yǎng)基中。根據(jù)優(yōu)化的保存條件,在22 ℃下,卵子在L-15培養(yǎng)基(pH=8.1)中保存2 h后的受精率和孵化率分別為66.4%和47.9%(圖1),相比在未優(yōu)化條件下,分別提高了22.2%和22.5%(見表1)。盡管如此,隨著保存時(shí)間的延長,卵子的活力仍急劇下降。在體外保存超過4 h 后,卵子的受精率和孵化率均顯著降低。

        3.3 血清在卵子保存中的作用

        因血清含有許多細(xì)胞生長必需的營養(yǎng)物質(zhì),被廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)。為了延長鞍帶石斑魚卵子保存的時(shí)間,我們嘗試在L-15 培養(yǎng)基中分別添加FBS 和GGS。結(jié)果表明,添加FBS 對鞍帶石斑魚卵子保存不利。在添加FBS 培養(yǎng)基中,我們觀察到卵子內(nèi)部含有分散的油球。油球被認(rèn)為是海洋魚類漂浮性卵子質(zhì)量的重要指標(biāo)[22-23]。在石斑魚卵母細(xì)胞成熟過程中,眾多小油球逐漸融合成一個(gè)較大的油球[15-16,24]。含有多油球的卵子其受精率顯著下降和孵化率低下[25]。在此,因FBS 添加而引起卵子內(nèi)形成多油球現(xiàn)象的原因尚不清楚。卵子在添加GGS的L-15培養(yǎng)基中保存4 h后,受精率和孵化率都有了顯著的提高。在梭鱸、露斯塔野鯪和小體鱘中,利用卵巢液成功地建立了卵子短期保存系統(tǒng)[8,11,26]。這些研究表明,魚類體液適合維持卵子的活力,有助于延長保存的時(shí)間。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充維生素預(yù)混料可有效地延長卵子的保存時(shí)間。在保存8 h 后,卵子的受精率仍保持在60%以上。研究表明,維生素對親魚的繁殖性能和卵子質(zhì)量起著關(guān)鍵作用[27]。在親魚培育中,通常在飼料中補(bǔ)充維生素以促進(jìn)卵子發(fā)育。然而,維生素對體外卵子保存的作用尚不清楚。一些維生素具有抗氧化的功能,在卵子保存過程中可能起到減少氧化反應(yīng)的作用。

        綜上所述,我們成功地建立了鞍帶石斑魚卵子體外短期保存的方法。保存溫度為22 ℃時(shí),在添加鞍帶石斑魚血清和維生素的L-15 培養(yǎng)基(pH=8.1)中,卵子可以在體外進(jìn)行短期的保存(約8 h)。該保存系統(tǒng)有助于提升鞍帶石斑魚的人工繁育、孵化管理和雜交試驗(yàn)等生產(chǎn)實(shí)踐的效率。

        猜你喜歡
        血清
        血清免疫球蛋白測定的臨床意義
        中老年保健(2021年3期)2021-08-22 06:50:04
        Meigs綜合征伴血清CA-125水平升高1例
        慢性腎臟病患者血清HIF-1α的表達(dá)及臨床意義
        慢性鼻-鼻竇炎患者血清IgE、IL-5及HMGB1的表達(dá)及其臨床意義
        血清H-FABP、PAF及IMA在冠心病患者中的表達(dá)及其臨床意義
        血清IL-6、APC、CRP在膿毒癥患者中的表達(dá)及臨床意義
        血清HBV前基因組RNA的研究進(jìn)展
        血清馴化在豬藍(lán)耳病防控中的應(yīng)用
        LC-MS/MS法同時(shí)測定養(yǎng)血清腦顆粒中14種成分
        中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:47
        血清胱抑素C與小動脈閉塞型卒中的關(guān)系
        亚洲 暴爽 av人人爽日日碰| 一本久久精品久久综合| 亚洲男女内射在线播放| 性色av无码中文av有码vr| 免费看又色又爽又黄的国产软件| 国产精品久久久久久52avav| 亚洲国产成人手机在线电影| 色哟哟精品中文字幕乱码| 国产极品裸体av在线激情网| 国产av永久无码天堂影院| 欧美成人免费观看国产| 中文字幕人妻少妇久久| 久久综合精品人妻一区二区三区| 国产女人水真多18毛片18精品| 久久中文字幕乱码免费| 亚洲国产av自拍精选| 亚洲一区二区三区偷拍厕所| 免费无码中文字幕a级毛片| 国产一区二区波多野结衣| 亚洲综合一区二区三区蜜臀av| 色偷偷亚洲精品一区二区| 后入内射国产一区二区| 久久男人av资源网站无码| 国产精品国产午夜免费福利看| 国产三级国产精品国产专播| av大全亚洲一区二区三区| 九九精品国产亚洲av日韩| 日本久久久免费高清| 久久精品av在线视频| 丰满人妻一区二区三区免费视频 | 日韩精品久久久肉伦网站| 日本午夜精品理论片A级APP发布| 日本一区二区高清视频在线播放| 亚洲中文字幕精品乱码2021| 久久精品免视看国产成人| 青青青伊人色综合久久亚洲综合| 日本二区三区在线免费| 精品偷拍被偷拍在线观看| 在线a免费观看| 国产一区二区一级黄色片| 色窝窝亚洲av网在线观看|