魏千皓，葉智鋒，王崇偉，林浩然，李水生，張勇

有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275

鞍帶石斑魚(yú)Epinephelus lanceolatus隸屬鱸形目，鮨科，石斑魚(yú)屬，主要分布于印度-太平洋地區(qū)，是大型的珊瑚礁魚(yú)類(lèi)。目前報(bào)道最大的鞍帶石斑魚(yú)個(gè)體長(zhǎng)達(dá)2.7 m，體質(zhì)量可達(dá)400 kg［1］。鞍帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)速度快，味道鮮美，是我國(guó)和東南亞國(guó)家重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。然而，鞍帶石斑魚(yú)人工繁殖難度大，受精卵價(jià)格昂貴。近年來(lái)，每公斤受精卵的價(jià)格在3 萬(wàn)～6 萬(wàn)元之間，仍供不應(yīng)求。鞍帶石斑魚(yú)的卵子主要通過(guò)激素催產(chǎn)獲得，其活力在接觸海水后迅速下降，從而導(dǎo)致受精失敗。配子保存是提高魚(yú)類(lèi)人工繁育效率的有效策略。目前，鞍帶石斑魚(yú)精子的長(zhǎng)期保存研究已經(jīng)開(kāi)展［2-3］。冷凍保存后的精子已應(yīng)用于不同石斑魚(yú)的種間雜交［4-5］。但是，鞍帶石斑魚(yú)卵子保存的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

由于魚(yú)類(lèi)卵子的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難像精子一樣進(jìn)行長(zhǎng)期保存，相較而言，短期的體外保存是可行的途徑。在金魚(yú)、鯉魚(yú)、虹鱒、小體鱘和梭鱸等魚(yú)類(lèi)中，已經(jīng)開(kāi)展了卵子的短期保存研究［6-11］，發(fā)現(xiàn)體外保存的卵子在數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)仍能保持較高的活力。對(duì)于生產(chǎn)和科研工作來(lái)說(shuō)，短期內(nèi)保持卵子活力有助于人工授精和孵化管理，可提高人工繁育的效率。為了保持鞍帶石斑魚(yú)卵子的活力和延長(zhǎng)體外保存的時(shí)間，本研究對(duì)卵子體外保存的條件進(jìn)行研究，建立適用于鞍帶石斑魚(yú)卵子體外保存的方法。

1 材料和實(shí)驗(yàn)

1.1 配子收集

鞍帶石斑魚(yú)的卵子采集于海南晨海水產(chǎn)有限公司感城養(yǎng)殖基地。于2020 年6～10 月，選擇處于生殖季節(jié)、腹部隆起、生殖孔紅腫凸起的鞍帶石斑魚(yú)親魚(yú)（10～12 齡，體質(zhì)量60～70 kg），在人工催產(chǎn)后，通過(guò)擠壓腹部使精子或卵子流出。將精液收集于50 mL 離心管中，然后4 ℃儲(chǔ)存直至使用。將卵子收集于干燥潔凈的500 mL玻璃燒杯中，然后分別放置于塑料培養(yǎng)皿中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 受精實(shí)驗(yàn)

將精子和卵子置于燒杯中輕輕混合，然后加入過(guò)濾海水激活精子與卵子。3 min 后，用干凈的海水清洗受精卵兩次，然后轉(zhuǎn)移至裝有10 L 的海水塑料桶中。在培育的過(guò)程中，保持充氣。培育4 h 后，待受精卵發(fā)育至囊胚期，在解剖顯微鏡下觀察，計(jì)算受精率［（受精率=（受精卵總數(shù)/卵子總數(shù)）×100%，n=1 000顆］。培育20 h后，在解剖顯微鏡下觀察，計(jì)算孵化率［孵化率=（孵化幼魚(yú)總數(shù)/卵子總數(shù)）×100%，n=1 000顆）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以逐步進(jìn)行的方式設(shè)計(jì)了6個(gè)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)卵子總數(shù)為n=1 000顆。

1.3.1 卵子保存培養(yǎng)基的確定 以無(wú)酚紅的Leibovitz's L-15（L-15）培養(yǎng)基、Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 （DMEM/F12）培養(yǎng)基、 Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI-1640）培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)保存液。以上培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)于武漢普諾賽生命科技有限公司。卵子和培養(yǎng)基大約按1∶6 的比例混合，28 ℃放置2 h，然后檢測(cè)卵子的受精率與孵化率。

1.3.2 保存溫度的測(cè)定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)1 的結(jié)果，將卵子置于L-15 培養(yǎng)基中，在不同溫度（16、22、28和32 ℃）下保存2 h，然后檢測(cè)卵子的受精率與孵化率。

1.3.3 培養(yǎng)基pH 值的測(cè)定 為了確定卵子保存的最佳培養(yǎng)基pH 值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)1 和2 的結(jié)果，將卵子分別放置在pH 值為7.4、7.8、8.1、8.5的L-15 培養(yǎng)基中。2 h 后，檢測(cè)卵子的受精率與孵化率。

1.3.4 保存時(shí)間對(duì)卵子活力的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)1、2 和3 的結(jié)果，將卵子保存在22 ℃的L-15 培養(yǎng)基（pH=8.1）中，分別在不同的保存時(shí)間（0、1、2、4 和6 h）后檢測(cè)卵子的受精卵與孵化率。

1.3.5 不同血清對(duì)卵子活力的影響 為了延長(zhǎng)卵子保存的時(shí)間，將不同劑量的胎牛血清（FBS，fetal bovine serum）和鞍帶石斑魚(yú)血清（GGS，giant grouper serum）分別添加進(jìn)L-15 培養(yǎng)基（pH=8.1）中。然后，將卵子置于含有血清的L-15 培養(yǎng)基中，22 ℃保存4 h，檢測(cè)卵子的受精卵與孵化率。鞍帶石斑魚(yú)血液樣品采集于處在繁殖季節(jié)的親魚(yú)，4 ℃以8 000×g速度離心15 min，分離血清樣品，放置-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.3.6 維生素預(yù)混料對(duì)卵子活力的影響 基于上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為了進(jìn)一步延長(zhǎng)卵子保存的時(shí)間，將20 mg/L 維生素預(yù)混料（廈門(mén)惠盈動(dòng)物科技有限公司）添加入含有0.1 μL/mL鞍帶石斑魚(yú)血清的L-15 培養(yǎng)基（pH=8.1）中。然后，將卵子置于添加維生素的培養(yǎng)基中，22 ℃時(shí)分別在0、2 、4 、6和8 h后檢測(cè)卵子的受精率和孵化率。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 23.0（SPSS，Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±S.E.M.。百分比數(shù)據(jù)在反正弦變換后進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)各組之間差異性，利用Fisher的最小顯著性差異法（LSD）進(jìn)行多重比較，取P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵子短期保存條件的優(yōu)化

剛擠出來(lái)的卵子，不經(jīng)過(guò)保存立即授精，其受精率和孵化率分別為（75.6±5.31）%和（59.7±6.92）%（表1）。而未受精的卵子在28 ℃下直接暴露于空氣中2 h，則完全失去活力。在28 ℃下，卵子在不同培養(yǎng)基中保存2 h 后，活力出現(xiàn)了顯著下降，受精率均低于50%（表1）。與在其他培養(yǎng)基中保存的卵子相比，在L-15 培養(yǎng)基中保存的卵子具有相對(duì)較高的受精率［（44.2±0.73）%］和較高的孵化率［（25.4±2.42）%］（表1）；表明L-15 培養(yǎng)基可能更適合作為卵子保存的培養(yǎng)液。在L-15 培養(yǎng)基中，保存溫度為16 ℃和22 ℃時(shí)，卵子的受精率和孵化率明顯高于28 ℃和32 ℃保存的卵子（表2）。由于卵子22 °C 保存后的受精率和孵化率高于16 ℃保存后的受精率和孵化率，因此選擇22.0 ℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的保存溫度。隨著pH 從7.4 升高到8.1，受精率與孵化率有增加的趨勢(shì)，但是統(tǒng)計(jì)數(shù)值沒(méi)有顯著差異（表3）。然而，由表3 可知，在培養(yǎng)基pH=8.1 時(shí)，保存后卵子的受精率和孵化率明顯高于在pH=8.4 時(shí)的受精率和孵化率。基于上述結(jié)果，組合優(yōu)化好的保存條件（22 ℃，pH=8.1 的L-15 培養(yǎng)基），對(duì)卵子體外保存的時(shí)間進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1顯示，卵子在保存液中2 h后，其受精率和孵化率分別為（66.4±2.70）%和（47.9±1.28）%；4 h 后，分 別 降 至（45.6±2.05）%和（25.8±1.67）%；6 h 后，分別降至（25.3±1.67）%和（11.6±1.06）%。

表1 鞍帶石斑魚(yú)卵子28 ℃時(shí)在不同培養(yǎng)基中保存2 h后的受精率和孵化率1）Table 1 Fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in different media at 28 ℃for 2 h

表2 溫度對(duì)鞍帶石斑魚(yú)卵子在L-15培養(yǎng)基中保存2 h后的受精率和孵化率的影響1）Table 2 Effects of temperatures on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium for 2 h

表3 鞍帶石斑魚(yú)卵子22 ℃時(shí)在不同pH值的L-15培養(yǎng)基中保存2 h后的受精率和孵化率1）Table 3 Effects of pH on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium at 22 ℃for 2 h

2.2 添加劑對(duì)卵子短期保存的影響

為了延長(zhǎng)卵子保存時(shí)間，在L-15 培養(yǎng)基中分別添加FBS 和GSS。如表4 所示，當(dāng)添加FBS 時(shí)，幾乎所有卵子都在保存4 h 后失去活力。而添加GSS 可以顯著提高卵子的活力。在含有0.1 μL/mL GGS的L-15培養(yǎng)基中，保存4 h后的卵子的受精率與孵化率分別為（67.6±2.88）%和（46.3±0.68）%（表4）。將20 mg/L 的維生素預(yù)混物添加進(jìn)含有0.1 μL/mL GGS 的L-15 培養(yǎng)基中，卵子保存的時(shí)間得到了明顯地提高。在保存8 h 后，卵子的受精率 和 孵 化 率 分 別 為（64.4±1.87）% 和（44.8±1.76）%，與4 h 和6 h 時(shí)的數(shù)值沒(méi)有顯著性差異，低于對(duì)照組（圖2）。

圖2 22 ℃L-15培養(yǎng)基（pH=8.1）添加鞍帶石斑魚(yú)血清和維生素預(yù)混料后，卵子不同保存時(shí)間后的受精率和孵化率Fig.2 The fertilization and hatching rates of giant grouper eggs at different storage time points in L-15 medium(pH=8.1)with supplementation GGS and vitamin premix at 22 ℃

表4 鞍帶石斑魚(yú)卵子22 ℃時(shí)在含不同血清的L-15培養(yǎng)基中保存4 h后的受精率和孵化率1）Table 4 Effects of sera supplementation on fertilization and hatching rates of giant grouper eggs stored in L-15 medium at 22 ℃for 4 h

3 討 論

3.1 卵子保存的基礎(chǔ)培養(yǎng)基探討

本研究首先對(duì)鞍帶石斑魚(yú)卵子體外保存的培養(yǎng)液進(jìn)行探討。L-15、DMEM/F12、RPMI-1640 和DMEM 培養(yǎng)基常用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。我們對(duì)這4種培養(yǎng)基進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明，卵子保存在L-15培養(yǎng)基中具有較高的受精率和孵化率（表1）。L-15是魚(yú)類(lèi)卵母細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基，具有維持卵母細(xì)胞活力的功能［12-14］。我們先前的研究亦表明，在L-15 培養(yǎng)基中，斜帶石斑魚(yú)的卵泡經(jīng)類(lèi)固醇激素誘導(dǎo)后可以發(fā)生生發(fā)泡破裂；卵母細(xì)胞可以正?；謴?fù)第一次減數(shù)分裂［15-16］。這些研究表明，L-15可用為石斑魚(yú)卵子保存的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

3.2 溫度和pH對(duì)卵子保存的影響

溫度是影響卵子保存效率的關(guān)鍵因素。不同魚(yú)類(lèi)的卵子對(duì)保存溫度的要求有很大的差別。有研究推測(cè)，保存溫度可能與魚(yú)類(lèi)棲息地的溫度有關(guān)。冷水性魚(yú)類(lèi)的卵子比暖水性魚(yú)類(lèi)的卵子更能耐受較低的保存溫度［8，17-18］。鞍帶石斑魚(yú)是一種熱帶魚(yú)類(lèi)。在海南省，其繁殖最適水溫為28～32 ℃。我們的結(jié)果表明，當(dāng)保存溫度為16 ℃和22 ℃時(shí)，卵子擁有較高的受精率和孵化率。因此，鞍帶石斑魚(yú)卵子保存的適合溫度為16 ～22 ℃。卵子保存的最適溫度低于養(yǎng)殖的最適溫度的現(xiàn)象在其他魚(yú)類(lèi)中也被觀察到。例如，小體鱘親魚(yú)在15 ℃下養(yǎng)殖，但卵子保存的適合溫度在7～11 ℃［8］。克林雷氏鯰的卵母細(xì)胞保存溫度為15 ℃，但親魚(yú)繁殖的水溫為25 ℃［19］。目前，關(guān)于卵子保存溫度低于親本養(yǎng)殖溫度的原因仍然未知。我們推測(cè)較低的溫度可能會(huì)降低卵細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)，從而有助于維持卵子的活力。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，pH 值的變化也會(huì)影響體外保存的卵子的活力［10，20-21］。虹鱒卵子在pH=8.2 的培養(yǎng)基中保存3 d 后的受精率高于在pH=9 和pH=10 的培養(yǎng)基中［10］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)卵子保存在pH=8.5 的L-15 培養(yǎng)基中，其活力顯著降低，但在pH 為7.4、7.8 和8.1 的培養(yǎng)基中，卵子的受精率和孵化率差異不顯著（表3）。由于pH 為8.1 時(shí)，保存后卵子的受精率和孵化率最高，因此建議鞍帶石斑魚(yú)卵子保存在pH=8.1 的培養(yǎng)基中。根據(jù)優(yōu)化的保存條件，在22 ℃下，卵子在L-15培養(yǎng)基（pH=8.1）中保存2 h后的受精率和孵化率分別為66.4%和47.9%（圖1），相比在未優(yōu)化條件下，分別提高了22.2%和22.5%（見(jiàn)表1）。盡管如此，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，卵子的活力仍急劇下降。在體外保存超過(guò)4 h 后，卵子的受精率和孵化率均顯著降低。

3.3 血清在卵子保存中的作用

因血清含有許多細(xì)胞生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)。為了延長(zhǎng)鞍帶石斑魚(yú)卵子保存的時(shí)間，我們嘗試在L-15 培養(yǎng)基中分別添加FBS 和GGS。結(jié)果表明，添加FBS 對(duì)鞍帶石斑魚(yú)卵子保存不利。在添加FBS 培養(yǎng)基中，我們觀察到卵子內(nèi)部含有分散的油球。油球被認(rèn)為是海洋魚(yú)類(lèi)漂浮性卵子質(zhì)量的重要指標(biāo)［22-23］。在石斑魚(yú)卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，眾多小油球逐漸融合成一個(gè)較大的油球［15-16，24］。含有多油球的卵子其受精率顯著下降和孵化率低下［25］。在此，因FBS 添加而引起卵子內(nèi)形成多油球現(xiàn)象的原因尚不清楚。卵子在添加GGS的L-15培養(yǎng)基中保存4 h后，受精率和孵化率都有了顯著的提高。在梭鱸、露斯塔野鯪和小體鱘中，利用卵巢液成功地建立了卵子短期保存系統(tǒng)［8，11，26］。這些研究表明，魚(yú)類(lèi)體液適合維持卵子的活力，有助于延長(zhǎng)保存的時(shí)間。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充維生素預(yù)混料可有效地延長(zhǎng)卵子的保存時(shí)間。在保存8 h 后，卵子的受精率仍保持在60%以上。研究表明，維生素對(duì)親魚(yú)的繁殖性能和卵子質(zhì)量起著關(guān)鍵作用［27］。在親魚(yú)培育中，通常在飼料中補(bǔ)充維生素以促進(jìn)卵子發(fā)育。然而，維生素對(duì)體外卵子保存的作用尚不清楚。一些維生素具有抗氧化的功能，在卵子保存過(guò)程中可能起到減少氧化反應(yīng)的作用。

綜上所述，我們成功地建立了鞍帶石斑魚(yú)卵子體外短期保存的方法。保存溫度為22 ℃時(shí)，在添加鞍帶石斑魚(yú)血清和維生素的L-15 培養(yǎng)基（pH=8.1）中，卵子可以在體外進(jìn)行短期的保存（約8 h）。該保存系統(tǒng)有助于提升鞍帶石斑魚(yú)的人工繁育、孵化管理和雜交試驗(yàn)等生產(chǎn)實(shí)踐的效率。