萬璐，閆佳佳，尤夢瑤，鄭春英*

(1.黑龍江大學 農業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2.黑龍江大學 生命科學學院，黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080)

甘草是一種天然、低熱、安全的甜味劑[1]，含有甘草皂苷、甘草黃酮、甘草多糖等多種次生代謝產物[2]，具有抗菌[3]、抗氧化[4]、抗病毒[5]等多種活性作用；現(xiàn)被廣泛應用于調味品、食品、醫(yī)藥等行業(yè)[6]。隨著甘草需求量的上漲及過度采挖，甘草已被列入國家《野生藥材資源保護管理條例》的二級保護植物[7]，盡管栽培種植在某種程度上緩解了甘草的匱乏，但甘草生長周期長，種植戶資金回籠慢。因此，尋找生產甘草次生代謝產物的新方法已成為研究熱點。

植物內生菌可以產生與宿主植物相同或相似的次生代謝產物[8]，將甘草內生菌作為發(fā)酵菌株，采用微生物發(fā)酵法生產甘草次生代謝產物，這對開發(fā)新資源，生產新型功能性調味品具有重要意義。本文以分離自甘草根部的內生真菌GRE111為研究對象，對其進行次生代謝產物篩選及抑菌活性研究，并對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化；同時，對其進行菌種鑒定，以便為采用微生物發(fā)酵法生產甘草次生代謝產物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌為內生真菌GRE111：分離自黑龍江省大慶地區(qū)野生甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)根部；NA、PDA培養(yǎng)基的配制方法參考文獻[9-10]；金黃色葡萄球菌等11株受試菌：購于黑龍江省微生物研究所；ITS序列通用引物ITS1、ITS4：由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；除液相用甲醇為色譜純級別外，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FL2200型高效液相色譜儀 浙江溫嶺福立分析儀器有限公司；HZQ-C型空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備

無菌條件下，取已活化的內生真菌GRE111，加適量無菌水，制成 1×107CFU/mL種子液；取GRE111種子液，以5%(體積比)接種至裝液量為50 mL的PDA培養(yǎng)基后，置于空氣浴搖床培養(yǎng)14 d(28 ℃，140 r/min)，終止發(fā)酵，抽濾，取濾液，作為發(fā)酵液供試品備用。

1.3.2 內生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分分析

內生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分分析采用HPLC法。

HPLC檢測條件：Venusil XBP-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm); 流動相：甲醇-水-冰醋酸(85∶14∶1)；流速 1 mL/min; 柱溫：25 ℃；檢測波長：254 nm。

供試品液的制備：取1.3.1發(fā)酵液供試品10 mL，減壓回收至干(50 ℃，0.1 MPa)，加1 mL甲醇溶解后，過濾(0.22 μm微孔濾膜)，取濾液作為供試品溶液。

對照品液的制備：精密稱取甘草次酸對照品適量，加甲醇溶解后，制成1 mg/mL的對照品溶液備用。

空白對照品液的制備：取PDA培養(yǎng)基10 mL，與供試品液的制備方法相同，制成空白對照品液。

HPLC分析：分別取供試品液、對照品液及空白對照品液各10 μL注入HPLC儀器。

1.3.3 內生真菌GRE111抑菌活性分析

取1.3.1發(fā)酵液，凍干，稱取適量，加甲醇溶解后制成0.1 mg/mL的甲醇提取物，分別以100 μg/mL鏈霉素和制霉素作為陽性對照，以甲醇溶液為空白對照，參考文獻[11]，采用瓊脂擴散法對內生真菌GRE111發(fā)酵液進行抗菌活性分析。

1.3.4 內生真菌GRE111發(fā)酵條件優(yōu)選

1.3.4.1 單因素實驗

a.接種量對抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液分別按3%、4%、5%、6%、7%、8%(體積比)的比例接種到50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)14 d(28 ℃，120 r/min)，按1.3.3測定發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑菌活性(n=3)。

b.裝液量對抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量分別接入裝有20，30，40，50，60，70 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)14 d，其他操作同1.3.4.1中a。

c.初始pH值對抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)14 d，其他操作同1.3.4.1中a。

d.發(fā)酵時間對抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中，分別發(fā)酵培養(yǎng)8，10，12，14，16，18 d，其他操作同1.3.4.1中a。

e.搖床轉速對抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中，分別發(fā)酵培養(yǎng)14 d，搖床轉速分別為100，120，140，160，180，200 r/min，其他操作同1.3.4.1中a。

f.發(fā)酵溫度對抑菌活性的影響

將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，搖床溫度分別設定為22，24，26，28，30，32 ℃，其他操作同1.3.4.1中a。

g.碳源及其質量濃度對抑菌活性的影響

分別選用0%、1%、2%、5%、10%(質量和體積比)的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為碳源制備1.3.1中PDA培養(yǎng)基，并將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量分別接入裝有50 mL初始pH為7.0的培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)14 d，其他操作同1.3.4.1中a。觀察不同質量濃度的碳源對抑菌活性的影響(n=3)。

h.氮源及其質量濃度對抑菌活性的影響

分別選用0%、0.5%、1%、1.5%、2%(質量和體積比)的牛肉膏、酵母膏、蛋白胨為氮源，加入1.3.1中PDA培養(yǎng)基中，其他發(fā)酵培養(yǎng)條件同1.3.4.1中g。觀察不同質量濃度的氮源對抑菌活性的影響(n=3)。

1.3.4.2 正交實驗

根據(jù)單因素實驗篩選結果，選取碳源濃度、氮源濃度、接種量和發(fā)酵時間4個因素作為實驗因素，采用L9(34)正交實驗設計優(yōu)化發(fā)酵條件，因素和水平見表1。

表1 正交實驗因素和水平

1.3.5 內生真菌GRE111的鑒定

內生真菌GRE111形態(tài)學觀察：參考文獻[12]的方法，將GRE111置于平板PDA培養(yǎng)基上(28 ℃，14 d)，觀察其菌落形狀、顏色、濃密程度、培養(yǎng)基內菌絲形態(tài)、是否產色素等；同時，取GRE111 PDA平板(培養(yǎng)時間3 d)，將無菌蓋玻片傾斜扦入該平板中，繼續(xù)培養(yǎng)5 d后，取出，鑷取蓋玻片，置于顯微鏡下觀察，初步確定菌株的分類地位[13]。

內生真菌GRE111 ITS序列分析：參考文獻[14]的方法提取菌株GRE111 DNA，PCR產物純化，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序工作。所測得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，利用MEGA 7構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定GRE111菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 內生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分分析結果

采用HPLC法對內生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分進行分析，結果見圖1。

圖1 GRE111發(fā)酵液活性成分分析結果

由圖1可知，在內生真菌GRE111發(fā)酵液中含有甘草次酸，且空白對照無干擾，說明內生真菌GRE111為甘草次酸產生菌。

2.2 內生真菌GRE111抑菌活性分析結果

對內生真菌GRE111發(fā)酵液進行抑菌活性分析，結果見表2。

表2 GRE111抑菌活性分析結果(n=3)

由表2可知，甘草內生真菌GRE111對10株致病菌均有一定的抑制作用，尤其對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑制作用最強。

2.3 內生真菌GRE111發(fā)酵條件優(yōu)選結果

2.3.1 單因素實驗結果

2.3.1.1 接種量對抑菌活性的影響結果

在不同接種量條件下，GRE111發(fā)酵液的抑菌活性結果見圖2。

由圖2可知，隨著GRE111接種量的增加，其發(fā)酵液的抑菌活性逐漸增強，當接種量為5%時，GRE111的抑菌活性最強，此后抑菌活性開始減弱。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是隨著GRE111接種量的增加，菌株生長密度增大，從而不利于抑菌活性物質的產生。

2.3.1.2 裝液量對抑菌活性的影響結果

不同裝液量對抑菌活性的影響結果見圖3。

圖3 不同裝液量對抑菌活性的影響

由圖3可知，裝液量在20%～50%范圍內變化時，GRE111抑菌活性逐漸增強，當裝液量持續(xù)增加時，抑菌活性開始減弱，這可能是由于裝液量的增加稀釋了抑菌活性物質，從而使抑菌活性出現(xiàn)減弱的情況。

2.3.1.3 初始pH值對抑菌活性的影響結果

不同初始pH值對抑菌活性的影響結果見圖4。

圖4 不同初始pH值對抑菌活性的影響

由圖4可知，當發(fā)酵液初始pH值由4.0增至9.0時，GRE111抑菌活性出現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，當初始pH值為7.0時，發(fā)酵液的抑菌活性最強，抑菌圈直徑為(26.71±0.04) mm左右，此后，隨著初始pH值的增加，GRE111抑菌活性開始減弱。上述結果表明，GRE111最適初始pH值為7.0。

2.3.1.4 搖床轉速對抑菌活性的影響結果

不同搖床轉速對抑菌活性的影響結果見圖5。

圖5 不同搖床轉速對抑菌活性的影響

由圖5可知，GRE111的抑菌活性隨著搖床轉速的增加而表現(xiàn)出先增強后減弱的趨勢，當搖床轉速為140 r/min時，抑菌活性最強，但搖床轉速過快也會影響GRE111菌株的正常生長。

2.3.1.5 發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌活性的影響

GRE111在不同培養(yǎng)時間下的抑菌活性測定結果見圖6。

圖6 不同發(fā)酵時間對抑菌活性的影響

由圖6可知，在不同的發(fā)酵時間下GRE111的抑菌活性表現(xiàn)出先增強后減弱的趨勢，這可能是由于GRE111菌株在發(fā)酵時間內，處于不同生長期，使其產生次生代謝產物的量有所不同。當培養(yǎng)時間為14 d時，GRE111的抑菌活性最強。

2.3.1.6 發(fā)酵溫度對抑菌活性的影響結果

不同發(fā)酵溫度對GRE111抑菌活性的影響結果見圖7。

圖7 不同發(fā)酵溫度對抑菌活性的影響

由圖7可知，GRE111的抑菌活性隨著發(fā)酵溫度的增加表現(xiàn)出先增強后減弱的趨勢，28 ℃時發(fā)酵液的抑菌效果最好，此后，隨著溫度升高，發(fā)酵液的抑菌活性顯著下降，這可能是由于溫度過高不利于GRE111菌株抑菌活性物質的產生。

2.3.1.7 不同碳源對抑菌活性的影響結果

不同碳源對抑菌活性的影響結果見圖8。

圖8 不同碳源質量濃度對抑菌活性的影響

由圖8可知，碳源不同，菌株GRE111的抑菌活性也不同，當葡萄糖為碳源，且其含量達到2%時，GRE111菌株的抑菌活性最強，因此選用2%的葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源含量。

2.3.1.8 不同氮源對抑菌活性的影響結果

不同氮源對抑菌活性的影響結果見圖9。

圖9 不同氮源質量濃度對抑菌活性的影響

由圖9可知，GRE111的抑菌活性與氮源的選擇和濃度有關。當1%蛋白胨作為氮源時，GRE111菌株發(fā)酵液的抑菌活性最強，因此選用1%的蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源。

2.3.2 正交實驗結果

正交實驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 正交實驗結果

表4 方差分析

由表3和表4可知，影響GRE111抑菌活性的因素順序為碳源質量濃度>氮源質量濃度>接種量>發(fā)酵時間。其中碳源質量濃度對GRE111抑菌活性的影響極顯著，氮源質量濃度對抑菌活性的影響顯著，發(fā)酵時間對抑菌活性無顯著影響，GRE111的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B3C2D2，即碳源(葡萄糖)質量濃度為1.0%，氮源(蛋白胨)質量濃度為1.0%，接種量為5%(體積比)，培養(yǎng)時間為14 d。綜合單因素實驗結果，GRE111的最佳發(fā)酵條件為：葡萄糖2%，蛋白胨1%，裝液量50%，接種量5%，初始pH值7.0，培養(yǎng)時間14 d，搖床轉速140 r/min。

分別采用最佳發(fā)酵條件及1.3.1發(fā)酵條件將內生真菌GRE111發(fā)酵培養(yǎng)后進行抑菌實驗，結果表明，采用最佳發(fā)酵工藝條件培養(yǎng)GRE111后，其抑菌活性為(28.30±0.50) mm，比對照組的抑菌活性提高3.32 mm。

2.4 內生真菌GRE111的鑒定結果

2.4.1 內生真菌GRE111形態(tài)學觀察結果

GRE111菌落在培養(yǎng)7 d后，菌落直徑為7 cm左右，綠色，基質黃色，菌落絮狀，菌絲密集，邊緣整齊，緊貼培養(yǎng)基，見圖10中a。GRE111產分生孢子，分生孢子的頂端形成掃帚狀的枝，最后一級分枝為小梗，由小梗形成鏈狀排列的分生孢子，見圖10中b。

a.GRE111菌落形態(tài) b.GRE111孢子顯微結構

2.4.2 內生真菌GRE111 ITS序列分析結果

甘草內生真菌 GRE111 DNA,PCR擴增后獲得1條500 bp的特異性條帶，將測序結果在 GenBank中進行Blast同源性比對，然后用MEGA 7軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖11)，內生真菌 GRE111 序列與青霉屬產黃青霉(Penicilliumchrysogenum, No.AJ608949.1)的相似度達到了99%，序列的同源性相似度為 99%。

圖11 內生真菌GRE111 系統(tǒng)發(fā)育樹

綜合GRE111形態(tài)學觀察結果，將甘草內生真菌GRE111鑒定為產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。

3 結論

從甘草根部分離得到一株可以產甘草次酸的內生真菌GRE111，甘草次酸是甘草甜素主要成分甘草酸的苷元，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種活性[15]。此外，該菌株具有較好的抑菌活性，發(fā)酵工藝經優(yōu)化后，最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基中葡萄糖質量濃度1.0%，蛋白胨質量濃度1.0%，初始pH值7.0，裝液量50%，接種量5%，培養(yǎng)時間14 d，搖床轉速140 r/min；該條件下，GRE111抑菌活性比未優(yōu)化前提高了3.32 mm；內生真菌GRE111鑒定為產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。產黃青霉是一種重要的工業(yè)用真菌[16]，常用于抗生素、食品及飲料的生產。上述結果為采用內生真菌GRE111發(fā)酵生產甘草次酸調味品奠定了基礎。