李澤林，李夢月，趙春燕，高燕，鄔文君，范江平，沈曉靜,2,3*

(1.云南農業(yè)大學 食品科學技術學院，昆明 650201；2.昆明醫(yī)科大學云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明 650500;3.云南農業(yè)大學 理學院，昆明 650201)

咖啡目前被超過80個國家種植，是茜草科(Rubiaceae)、咖啡屬(Coffea)植物，主要分布于中美洲、非洲、亞洲等地[1]?？Х戎泻写罅康木G原酸、咖啡酸、阿魏酸、咖啡因等生物活性化合物，是世界上最受歡迎的飲料之一[2]。近年來，中國咖啡消費量逐年增加，是世界上最大的咖啡潛在的消費市場。云南小?？Х纫蚱洹皾舛豢?、香而不烈、略帶果味”的獨特風味而備受消費者和國際咖啡市場喜愛[3]?？Х裙ぷ鳛榭Х壬a加工過程中第一副產物，其產量隨著咖啡消費的增加而日益增長。據報道，在云南小粒咖啡的生產過程中，每年需處理的果皮殘渣約39.68萬噸[4-5]，這些咖啡果皮除部分用作堆肥[6]或用于制作咖啡果皮茶[7]、果酒[8]等產品外，絕大部分仍被作為廢棄物丟棄，因而造成環(huán)境污染和資源浪費。近年來，有研究者提出從咖啡果皮中提取果膠，以達到分解咖啡果皮的目的，最終使其經濟效益和實際使用價值增加。

果膠是一種廣泛存在于高等植物初級細胞壁和細胞之間區(qū)域的酸性雜多糖，多為半乳糖醛酸及其衍生物[9-10]。因其具有良好的凝膠性、吸附性、乳化性、增稠性等，在食品工業(yè)中常被用作凝膠劑、增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑等[11-12]。此外，果膠結構和組成比較特殊，具有抗腫瘤[13]、降血糖[14]、調節(jié)腸道菌群、提高免疫力[15]以及調節(jié)慢性疾病等功能。目前，果膠的提取方法主要有酸提法、離子交換法、微波提取法、鹽析法、酶法等[16]。因此，從咖啡果皮中提取果膠一方面將解決咖啡生產中大量果皮帶來的環(huán)境問題，另一方面提取的果膠可用于食品、醫(yī)藥領域，滿足市場需求。

現(xiàn)有研究顯示熱水法提取的咖啡果膠具有較好的抑菌和抗氧化作用[17-18]。本研究擬在單因素試驗的基礎上，采用響應面設計優(yōu)化云南小?？Х裙すz的酶法提取工藝，并通過傅里葉紅外光譜檢測粗果膠的官能團組成，旨在為云南小?？Х裙さ木C合利用及果膠產品的開發(fā)提供理論依據和前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南小?？Х裙?阿拉比卡)：云南省保山市潞江壩；纖維素酶(10000 U/g)：瑪雅試劑有限公司；無水乙醇(分析純)：天津市風船化學試劑科技有限公司；pH計電極保護液：上海雷磁儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-48型打粉機 寧波新芝生物科技有限公司；Nexus 470 FTIR型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；DHG-9070A型電熱鼓風干燥機 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

將咖啡果皮在45 ℃鼓風干燥箱中干燥至含水率低于5%，打粉，過80目篩，備用。準確稱取20 g咖啡果皮干粉，在pH 5.0下加入纖維素酶水解后過濾得到濾液，旋轉蒸發(fā)將其濃縮至原體積的1/4，加入等體積的乙醇過夜沉淀，離心分離留沉淀，取少量蒸餾水溶解后真空冷凍干燥，計算果膠得率。

1.4 果膠提取單因素試驗

1.4.1 提取時間對果膠提取率的影響

考察提取時間對咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、提取溫度為50 ℃、pH 為5.0和料液比為1∶20，設置酶解時間分別為1，2，3，4，5 h，對果皮果膠進行酶提取，測定果膠提取率。

1.4.2 酶添加量對果膠提取率的影響

考察酶添加量對咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定提取溫度為50 ℃、pH為 5.0、酶解時間為3 h和料液比為1∶20，設置纖維素酶添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，對果皮果膠進行酶提取，測定果膠提取率。

1.4.3 pH值對果膠提取率的影響

考察pH對咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、提取溫度為50 ℃、酶解時間為3 h和料液比為1∶20，設置pH分別為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，對果皮果膠進行酶提取，測定果膠提取率。

1.4.4 料液比對果膠提取率的影響

考察料液比對咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、提取溫度為50 ℃、pH為 5.0和酶解時間為3 h，設置料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，對果皮果膠進行酶提取，測定果膠提取率。

1.4.5 提取溫度對果膠提取率的影響

考察提取溫度對咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、pH為 5.0、酶解時間為3 h和料液比為1∶20，設置提取溫度分別為35，40，45，50，55 ℃，對果皮果膠進行酶提取，測定果膠提取率。

1.5 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，以果膠提取率為指標，選取pH、提取溫度、酶添加量和料液比4個因素，通過四因素三水平響應面分析法進行響應面優(yōu)化試驗(見表1)，得到最佳酶提取工藝。

表1 響應面試驗因素水平設計

1.6 紅外光譜檢測

準確稱取咖啡果膠樣品1 mg，采用KBr壓片法進行檢測，在500～4000 cm-1范圍內進行掃描。

1.7 數(shù)據處理

所有試驗均重復3次，數(shù)據以平均值±標準差表示。采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計與分析，利用Origin 2020作圖。

2 結果與分析

2.1 果膠提取單因素試驗結果與分析

單因素試驗結果見圖1。

圖1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對果膠提取率的影響

由圖1中a可知，隨著提取時間的增加，咖啡粗果膠提取率隨之上升；當提取時間為3 h時，提取率達到最大值(8.31±0.36)%；超過3 h后，果膠提取率降低，原因可能是提取時間過長，酶活性下降，導致果膠提取率變低。因此，提取3 h為最優(yōu)時間。

2.1.2 酶添加量對果膠提取率的影響

由圖1中b可知，當酶添加量從0.5%增加到1.0%時，粗果膠提取率迅速達到最大值(9.4±0.79)%，但是當酶添加量大于1.0%時，提取率出現(xiàn)逐漸下降的趨勢，可能是因為反應底物在酶添加量為1.0%時剛好酶解完全，隨著酶添加量的增加可能起到相反的效果。因此，酶添加量1.0%為最優(yōu)值。

2.1.3 pH值對果膠提取率的影響

由圖1中c可知，隨著酶解液pH的增加，果膠提取率在pH值為5.0時達到最大值(10.1±0.97)%；pH值大于5.0，提取率降低。表明pH 5.0是纖維素酶的最適pH值，能夠最大限度釋放咖啡果膠。

2.1.4 料液比對果膠提取率的影響

由圖1中d可知，料液比為1∶20時，果膠提取率達到最大值(9.0±0.56)%；料液比大于1∶20時，提取率降低，原因是液體過少時反應不充分，液體過多時稀釋了酶濃度使酶活力下降。因此，1∶20為最佳料液比。

2.1.5 提取溫度對果膠提取率的影響

溫度是影響酶活性最重要的條件之一。由圖1中e可知，提取溫度由35 ℃上升到50 ℃時提取率持續(xù)增加，并且在50 ℃時達到最大值(10.42±0.87)%；但是當提取溫度大于50 ℃時，果膠提取率降低，原因是溫度升高抑制了酶活性，從而降低了提取率。因此，溫度為50 ℃時最適宜。

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗結果

響應面優(yōu)化試驗設計與結果見表2，以果膠提取率(Y)為考察響應指標，建立其與pH(A)、提取溫度(B)、酶添加量(C)和料液比(D)的回歸模型，得到二次多項回歸方程為：

表2 響應面試驗設計及結果

續(xù) 表

Y=8.00-8.333E-003A-0.30B+0.50C+0.37D+0.40AB+0.38AC-0.95AD-1.31BC-0.65BD+0.100CD-2.01A2-1.00B2-0.81C2-0.79D2。

由表3可知，對回歸模型方差進行分析， 回歸模型顯著(P<0.05)，模型決定系數(shù)R2=0.7318>0.7，說明模型與實際試驗擬合良好，該擬合方程能較好呈現(xiàn)出果膠提取率與各因素間的關系。失擬項不顯著(P>0.05)，說明響應面優(yōu)化得到的最佳提取工藝具有可行性。模型中，一次項A、B、C、D，交互項AB、AC、AD、BC、BD、CD，二次項A2、B2、C2、D2對粗果膠提取率均有影響，但是只有BC(P<0.05)和A2(P<0.01)具有顯著性，根據F值可以得出各因素對提取率的影響順序為酶添加量>料液比>提取溫度>pH。

表3 回歸模型方差分析及模型顯著性檢驗

續(xù) 表

2.2.2 交互作用分析

根據回歸分析結果制作相應的等高線圖和響應面曲線圖，見圖2。

圖2 各因素交互作用對果膠得率影響的三維曲面和等高線

隨著提取溫度的升高，咖啡果膠提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；隨著pH的增加，咖啡果膠提取率也呈現(xiàn)先升到最大值后緩慢下降的趨勢。pH(A)與提取溫度(B)的等高線圖接近圓形，說明兩因素的交互作用不顯著，但是相互影響(見圖2中a)。隨著酶添加量的增加和pH的增大，果膠提取率逐漸升高，達到最高值后呈下降趨勢，pH(A)與酶添加量(C)的等高線圖接近圓形，說明兩因素的交互作用不明顯(見圖2中b)。隨著酶添加量的增加，果膠提取率緩慢增大，在達到最大值后迅速降低；隨著提取溫度的增加，果膠提取率先迅速升高到最大值之后逐漸降低；由酶添加量和提取溫度的等高線圖可知，等高線沿著酶添加量軸密集且呈橢圓形，說明提取溫度(B)和酶添加量(C)的交互作用顯著(P<0.05)(見圖2中c)。隨著料液比(D)和酶添加量(C)的增加，咖啡果膠提取率增大，但是兩者交互作用不顯著(見圖2中d)，這些結果與前人的研究報道相似[19-20]。綜上所述，各因素對咖啡果膠的提取率均相互影響，但是只有提取溫度(B)和酶添加量(C)的交互作用顯著，影響提取的主次順序為酶添加量>料液比>提取溫度>pH。

2.2.3 模型驗證

通過模型優(yōu)化確定咖啡果膠的最佳工藝條件：提取溫度為45 ℃，溶劑pH 為4.9，酶添加量為1.5%及料液比為1∶24.65，理論上得到咖啡果膠提取率為9.18%。以上預測最優(yōu)的工藝條件重復3次試驗，得到實際的咖啡果膠提取率為(10.30±1.28)%，與理論預測值接近且無顯著差異，可見該模型能較好地預測和模擬試驗中咖啡果膠的提取率。

2.3 紅外光譜結果分析

圖3 云南小?？Х裙すz的紅外光譜

3 結論

本研究優(yōu)化了云南小?？Х裙ぶ泄z的提取工藝，表征了所得粗果膠的結構。結果表明，云南小粒咖啡果皮果膠的最優(yōu)酶提取工藝條件為提取溫度45 ℃、pH 4.9、酶添加量1.5%及料液比1∶24.65，提取率為9.18%。紅外光譜表明，咖啡果膠是具有典型多糖結構的酸性雜多糖。本研究將為云南小粒咖啡果皮果膠的開發(fā)利用提供試驗基礎和參考依據。