王可堯，任仙娥，楊鋒，黃永春，張昆明，劉純友，黃承都

(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006)

大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且不含膽固醇，因其具有良好的理化性質(zhì)和加工特性而被充分應(yīng)用于食品工業(yè)中[1-3]。豌豆分離蛋白(pea protein isolate，PPI)生物價(jià)高，富含促進(jìn)人體肌肉增長(zhǎng)的賴氨酸和可以提鮮調(diào)味的谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸[4]，其亞基組成和SPI相似，且不含過(guò)敏原，但因PPI功能性較SPI差，且SPI在植物蛋白中優(yōu)勢(shì)較多，其在食品領(lǐng)域中利用率低[5]，因此考慮在PPI中添加有較好功能特性的SPI，制備出一種低脂、低膽固醇和高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的SPI和PPI復(fù)合熱促凝膠。熱促凝膠的形成大致分為三步:首先,在一定強(qiáng)度的熱處理后，蛋白分子間共價(jià)鍵或次級(jí)鍵遭到破壞，亞基逐漸去折疊，功能基團(tuán)暴露；其次,蛋白分子間彼此靠近，通過(guò)分子間相互作用發(fā)生聚集；最后,聚集的蛋白相互交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[6]。

SPI和PPI作為植物蛋白中應(yīng)用最為廣泛的兩種蛋白質(zhì)，將兩者共混應(yīng)用于植物基食品的開(kāi)發(fā)中有利于提高食品的總營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為消費(fèi)者提供健康新選擇。本文以植物混合蛋白凝膠為模型研究不同蛋白濃度和不同比例下(11%、14%、17%)復(fù)合SPI和PPI熱促凝膠特性，利用流變儀模擬凝膠形成的全過(guò)程，利用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定其成膠強(qiáng)度，通過(guò)凝膠的持水率結(jié)果來(lái)判斷凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的優(yōu)良程度。研究在17%濃度下復(fù)合熱促凝膠的分子間作用力大小和類型，探索凝膠結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異的原因，最后利用掃描電子顯微鏡來(lái)觀察其微觀結(jié)構(gòu)差異，從而為設(shè)計(jì)植物基食品的結(jié)構(gòu)和功能提供理論指導(dǎo)，為開(kāi)發(fā)新類型不同種類植物基食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白含量≥90%)：山東禹王生態(tài)實(shí)業(yè)有限公司；豌豆分離蛋白(蛋白含量≥80%)：煙臺(tái)雙塔食品股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MCR 72旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利Anton Paar有限公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國(guó)Stable Micro System公司；JXN-26高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特股份有限公司；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司；LGJ-10D臺(tái)式冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；Phenom ProX掃描電子顯微鏡 上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合凝膠流變學(xué)分析

配制蛋白濃度分別為11%、14%、17%，蛋白質(zhì)比例(SPI和PPI的比例)分別為1∶0、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1的SPI和PPI混合蛋白溶液，使用2 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，磁力攪拌2 h，使其充分溶解。

采用旋轉(zhuǎn)流變儀模擬凝膠形成全過(guò)程。選用PP50平行板(直徑50 mm；間隙值1 mm)，上樣后刮除多余液體，在轉(zhuǎn)子四周滴加硅油以防止溫度過(guò)高使水分蒸發(fā)。整個(gè)過(guò)程中溫度掃描參數(shù)為：1 Hz和應(yīng)變0.5%，以2 ℃/min的速度從25 ℃升高至95 ℃，然后在95 ℃下保溫30 min，再以2 ℃/min的速度降溫至25 ℃，記錄儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)隨時(shí)間和溫度的變化情況[7]。

1.3.2 復(fù)合熱促凝膠的制備

將上述配制好的混合蛋白溶液分裝至玻璃瓶中，封上蓋子，于恒溫水浴鍋中95 ℃熱處理30 min，冰水浴冷卻到室溫后，于4 ℃過(guò)夜保存，測(cè)試前需于室溫下放置30 min。

1.3.3 復(fù)合凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

利用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀對(duì)制得的凝膠樣品進(jìn)行凝膠強(qiáng)度測(cè)定。條件設(shè)定為：探頭類型P/0.5；測(cè)試前速度5.0 mm/s，測(cè)試速度1.0 mm/s和測(cè)試后速度5.0 mm/s；觸發(fā)力為3 g。探頭下壓至10 mm時(shí)出現(xiàn)的最大的力定義為凝膠強(qiáng)度。

1.3.4 復(fù)合凝膠持水率的測(cè)定

稱取約5 g復(fù)合凝膠樣品裝入10 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速10000 r/min離心10 min，用濾紙小心吸出離心后樣品瀝出的水分，稱取重量，持水率計(jì)算公式為：

式中：W1為樣品質(zhì)量(g)，A為蛋白濃度，W2為樣品瀝出水分后的質(zhì)量(g)。

1.3.5 復(fù)合凝膠分子間作用力的測(cè)定

參照Tanger等[8]的測(cè)定方法，并稍作調(diào)整。用大蒜壓榨器將蛋白濃度為17%的復(fù)合凝膠樣品壓碎，分別稱取0.5 g樣品于三角燒瓶中，加入20 mL S1(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.5)，置于恒溫?fù)u床中振蕩1 h使其充分溶解，于10000 r/min離心15 min得上清液；取沉淀加入20 mL S2(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液+2 g/L SDS，pH 7.5)振蕩、離心后得上清液；再取沉淀加入20 mL S3(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液+2 g/L SDS+15 g/L二硫蘇糖醇，pH 7.5)振蕩、離心后得上清液，向上述各步離心后所得上清液中加入20 mL 20 g/dL的三氯乙酸，離心取沉淀加入1 mol NaOH溶解，離心得上清液，采用福林酚比色法測(cè)定其可溶性蛋白質(zhì)含量。溶解于S1的蛋白質(zhì)含量代表靜電作用的貢獻(xiàn)，溶解于S2的蛋白質(zhì)含量代表疏水相互作用的貢獻(xiàn)，溶解于S3的蛋白質(zhì)含量代表二硫鍵的貢獻(xiàn)。

1.3.6 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

將17%的復(fù)合凝膠樣品冷凍干燥后取小塊顆粒，使用導(dǎo)電雙面膠將其固定在樣品臺(tái)上，通過(guò)離子濺射噴金處理，噴金時(shí)間為20 s。噴金結(jié)束后，將樣品臺(tái)放入掃描電子顯微鏡后對(duì)凝膠微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察記錄。測(cè)試條件為加速電壓10 kV，放大倍數(shù)300倍。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

文中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3組，每組至少3個(gè)平行。通過(guò)SPSS 22.0軟件Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，圖片通過(guò)Origin 8.0軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合凝膠流變學(xué)性質(zhì)

儲(chǔ)能模量G′代表固體性質(zhì)，與凝膠彈性有關(guān)；損耗模量G″代表液體性質(zhì)，與凝膠黏性相關(guān)[9]。11%、14%和17%濃度下不同蛋白比例的SPI和PPI復(fù)合蛋白熱促凝膠形成曲線隨時(shí)間和溫度的變化情況見(jiàn)圖1。

圖1 SPI與PPI復(fù)合凝膠流變學(xué)

由圖1可知，在升溫-保溫-降溫的熱循環(huán)過(guò)程中，復(fù)合蛋白的G′和G″變化趨勢(shì)基本一致。

在11%、14%和17%濃度下，SPI和PPI的比例為1∶0和3∶1時(shí)，以及在14%和17%濃度下，SPI和PPI的比例為1∶1時(shí)，復(fù)合凝膠的G′值始終大于G″值，且在升溫過(guò)程中，G′和G″表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢(shì)，此過(guò)程包括凝膠形成、凝膠消弱和凝膠提高3個(gè)階段[10]。由于SPI黏度大，一開(kāi)始G′值就大于G″值，表現(xiàn)出固體性質(zhì)。隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間和蛋白質(zhì)與水之間的氫鍵斷裂，體系的黏度下降，因此，G′值和G″值隨溫度的增加反而不斷下降。PPI的變性溫度大約在75～85 ℃，而SPI的變性溫度在85～95 ℃，在保溫階段，95 ℃已達(dá)到SPI和PPI完全失活溫度，復(fù)合蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)、巰基、二硫鍵等基團(tuán)暴露，蛋白分子間交聯(lián)聚集轉(zhuǎn)變?yōu)楦佑行虻哪z網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，G′值和G″值持續(xù)增加。在降溫階段，隨著溫度的下降，凝膠結(jié)構(gòu)G′值和G″值持續(xù)增加，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步穩(wěn)固。

在11%濃度下，SPI和PPI蛋白比例為1∶1時(shí)，在14%濃度下，蛋白比例為1∶3時(shí)，以及在17%濃度下，蛋白比例為1∶3和0∶1時(shí)，體系初始的G′小于G″，這可能是因?yàn)殡S著豌豆蛋白比例的增加，體系的黏度降低。隨著溫度的升高，G′增加的速度大于G″，G′和G″出現(xiàn)交點(diǎn)，標(biāo)志著三維網(wǎng)絡(luò)開(kāi)始建立，此時(shí)的溫度和時(shí)間被稱為成膠溫度和成膠時(shí)間。隨后，G′開(kāi)始大于G″，蛋白分子間發(fā)生聚集交聯(lián)，模量增加，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不斷加強(qiáng)，在該階段二硫鍵促進(jìn)分子間重排，形成穩(wěn)固的凝膠結(jié)構(gòu)。在降溫階段，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要由氫鍵來(lái)維持，較低溫度下有利于氫鍵的形成，G′和G″持續(xù)增加。

在11%濃度下，當(dāng)SPI和PPI蛋白比例為1∶3和0∶1時(shí)，以及在14%濃度下，蛋白比例為0∶1時(shí)，G″值一直處于大于G′值的狀態(tài)，凝膠未形成，此時(shí)的濃度未達(dá)到形成凝膠的濃度。在不同濃度下，隨著蛋白濃度的增加，同一比例下最終形成凝膠的儲(chǔ)能模量值不斷增加。在不同的比例下，隨著PPI的增加，最終形成凝膠的儲(chǔ)能模量值不斷下降，這可能是由于PPI稀釋了有較強(qiáng)SPI凝膠的G′值，說(shuō)明SPI凝膠樣品相比PPI凝膠具有較高的類固體性質(zhì)，因此可通過(guò)調(diào)控不同的SPI和PPI濃度及比例，降低PPI的成膠濃度。

2.2 復(fù)合凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

分析不同蛋白濃度下SPI和PPI以不同比例混合形成的復(fù)合熱促凝膠強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 SPI 與PPI復(fù)合熱促凝膠強(qiáng)度(g)

由表1可知，隨著蛋白濃度的增加，凝膠強(qiáng)度顯著升高(P<0.05)；同一濃度下，隨著PPI比例的增加，凝膠強(qiáng)度顯著下降(P<0.05)。蛋白濃度是熱促凝膠形成的決定性因素之一[11]，蛋白濃度越高，凝膠強(qiáng)度越大，其原因主要是隨著蛋白濃度的增加，熱誘導(dǎo)可暴露更多的活性基團(tuán)數(shù)目，提高了蛋白分子間交聯(lián)聚集的機(jī)會(huì)，因此形成了更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠強(qiáng)度也隨之增大[12]，這與流變最終的儲(chǔ)能模量測(cè)定結(jié)果一致。對(duì)于SPI，僅通過(guò)熱處理方式自發(fā)形成凝膠的蛋白臨界濃度為8%，而對(duì)于PPI，形成凝膠所需的最低蛋白濃度為16%[13]，當(dāng)?shù)陀谧畹统赡z蛋白濃度時(shí)，蛋白樣品僅靠加熱的方式無(wú)法形成凝膠。因此，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?1%、SPI和PPI蛋白比例為1∶3和0∶1時(shí)，以及蛋白濃度為14%、SPI和PPI蛋白比例為0∶1時(shí)，復(fù)合蛋白不能通過(guò)熱處理自發(fā)成膠。當(dāng)復(fù)合蛋白濃度為17%時(shí)，均能形成熱不可逆的凝膠樣品。此外，在不同比例下，由于PPI含硫氨基酸含量較SPI少[14]，SPI對(duì)復(fù)合體系凝膠強(qiáng)度起主要作用，隨著PPI添加量的增大，稀釋了有較強(qiáng)凝膠特性的SPI，凝膠強(qiáng)度不斷降低。

2.3 復(fù)合凝膠持水率分析

持水率是指蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)有效固定水分子的能力強(qiáng)弱，是反映凝膠網(wǎng)絡(luò)優(yōu)良的重要指標(biāo)[15]。不同蛋白比例和蛋白濃度下復(fù)合熱促凝膠的持水率見(jiàn)表2。

表2 SPI與PPI復(fù)合熱促凝膠持水率(%)

由表2可知，隨著蛋白濃度的增加，凝膠持水率變化趨勢(shì)與儲(chǔ)能模量、凝膠強(qiáng)度結(jié)果一致，說(shuō)明蛋白濃度的增加使蛋白分子間交聯(lián)密切，有利于形成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密、有序，持水率越高。單一SPI凝膠在11%、14%和17%濃度下和復(fù)合SPI和PPI在蛋白濃度為14%和17%、蛋白比例為3∶1時(shí)，持水率均接近100%，說(shuō)明在高濃度下SPI和少量添加PPI形成的凝膠結(jié)構(gòu)十分致密，在高速離心力作用下不受破壞，幾乎沒(méi)有水分滲出。隨著PPI比例的持續(xù)增加，復(fù)合凝膠持水率顯著降低(P<0.05)。一方面可能是由于PPI的溶解度低于SPI[16]，PPI在形成凝膠網(wǎng)絡(luò)時(shí)不易更好地結(jié)合水分子，因此持水率下降。另一方面，PPI比SPI含硫氨基酸含量少，形成的凝膠強(qiáng)度低，因此凝膠結(jié)構(gòu)持水率低于SPI。

2.4 復(fù)合凝膠形成的分子間作用力分析

形成和維持蛋白質(zhì)熱促凝膠的主要作用力包括靜電作用、疏水相互作用等非共價(jià)鍵和二硫共價(jià)鍵[17]，分子間作用力的大小、類型不同凝膠結(jié)構(gòu)性質(zhì)也會(huì)有所差異[18]。通過(guò)添加不同的變性劑，采用逐步溶解的方法，測(cè)得上清液中蛋白質(zhì)的溶解性大小，可間接反映維持凝膠穩(wěn)定的靜電作用、疏水相互作用和二硫鍵大小[19]。17%蛋白濃度下復(fù)合凝膠形成的分子間作用力結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 SPI與PPI復(fù)合凝膠分子間作用力

由圖2可知，靜電作用隨著PPI蛋白比例的增高而顯著升高(P<0.05)；疏水相互作用先升高后降低，在SPI和PPI的比例為1∶3時(shí)達(dá)到最大；二硫鍵顯著降低(P<0.05)。在熱誘導(dǎo)中，二硫鍵是維持SPI凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要作用力，靜電作用和疏水相互作用對(duì)維持PPI凝膠網(wǎng)絡(luò)貢獻(xiàn)較大，因此SPI形成的凝膠結(jié)構(gòu)較PPI更為穩(wěn)固。靜電作用隨著PPI含量的增加不斷增大，在pH 8.0實(shí)驗(yàn)條件下，pH遠(yuǎn)離SPI和PPI蛋白等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)表面帶有大量的凈負(fù)電荷，此時(shí)靜電斥力占主導(dǎo)，蛋白質(zhì)間難以聚集成膠，當(dāng)靜電斥力與吸引力主要是疏水相互作用達(dá)到平衡時(shí)，才有可能形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而當(dāng)引力大于斥力時(shí)，形成高度脫水收縮的不透明凝膠結(jié)構(gòu)。在熱處理過(guò)程中，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)打開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，疏水相互作用增強(qiáng)，隨著PPI比例的增加，疏水相互作用顯著增高(P<0.05)，可能是由于PPI中疏水性氨基酸的含量高于SPI[20]，但單一PPI蛋白凝膠疏水相互作用略有降低，可能是由于95 ℃遠(yuǎn)高于PPI的變性溫度，蛋白聚集程度增高，一部分的疏水基團(tuán)因聚集作用重新被包埋在蛋白分子內(nèi)，導(dǎo)致疏水相互作用有所降低。二硫鍵是形成蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要作用力，二硫鍵隨著PPI含量的增加不斷降低，可能是由于PPI含硫氨基酸含量小于SPI，此結(jié)果導(dǎo)致PPI凝膠儲(chǔ)能模量、硬度和持水率均小于SPI。

2.5 復(fù)合凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

利用掃描電子顯微鏡對(duì)17%蛋白濃度下凝膠微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 SPI與PPI復(fù)合凝膠微觀結(jié)構(gòu)

由圖3可知，不同比例下凝膠的微觀結(jié)構(gòu)有較大的差異。SPI凝膠表面質(zhì)密、孔洞均勻，蛋白質(zhì)分子間從各個(gè)角度進(jìn)行交聯(lián)，相互交織，形成穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)。當(dāng)SPI和PPI的比例為3∶1時(shí)，凝膠孔徑變大，說(shuō)明少量PPI的加入導(dǎo)致SPI凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變差。當(dāng)SPI和PPI的比例為1∶0和3∶1時(shí)，凝膠微觀結(jié)構(gòu)立體感更強(qiáng)，可能導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度、持水率更好。隨著PPI組分的增加，凝膠結(jié)構(gòu)越趨于片層狀，形成不規(guī)則的斷層，使總體結(jié)構(gòu)顯得粗糙。分析不同比例下凝膠微觀結(jié)構(gòu)差異的原因，可能是隨著PPI比例的增加，維持凝膠分子間作用力的不同，主要是二硫鍵含量的減少，導(dǎo)致凝膠質(zhì)地變差。

3 結(jié)果與討論

本文以SPI和PPI為原料，通過(guò)對(duì)11%、14%和17%濃度下復(fù)合熱促凝膠特性的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白濃度越高，儲(chǔ)能模量、凝膠強(qiáng)度和持水率越高。同時(shí)，兩種植物蛋白的凝膠性差異較大，隨著PPI比例的增加，復(fù)合蛋白最終形成凝膠的儲(chǔ)能模量、凝膠強(qiáng)度和持水率呈不斷下降的趨勢(shì)，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)質(zhì)地越來(lái)越松散、零碎，蛋白間交聯(lián)度減弱，凝膠性能逐漸變差。分析復(fù)合熱促凝膠分子間作用力發(fā)現(xiàn)疏水相互作用和二硫鍵對(duì)SPI凝膠貢獻(xiàn)較大，靜電作用和疏水相互作用對(duì)PPI凝膠貢獻(xiàn)較大，分子間作用力的類型不同暗示著SPI和PPI凝膠性能不盡相同，因此通過(guò)在PPI中添加SPI可提高PPI的凝膠特性，提高PPI在食品工業(yè)中的利用率，同時(shí)也為不同植物基蛋白產(chǎn)品的復(fù)配研究提供了理論依據(jù)。