楊康，伍建榕，王瑋瑋

1.貴州林業(yè)勘察設(shè)計(jì)有限公司，貴州貴陽(yáng) 550000；

2.西南林業(yè)大學(xué)，云南昆明 650224

1 研究區(qū)概況

昆明市祿勸縣位于昆明市北部，距昆明市區(qū)90km，年平均氣溫15.6℃。境內(nèi)氣候垂直分布，最高海拔3000m，最低海拔746m。東西寬69km，南北長(zhǎng)105km，總面積4249km2。其中，山區(qū)面積占全縣總面積的98.4%。屬亞熱帶氣候，日照充足，四季如春，氣候宜人，干濕季分明。祿勸縣的中國(guó)櫻桃成熟時(shí)間一般在4 月上中旬，要比北方產(chǎn)區(qū)提前1～2 個(gè)月上市，基本上在雨季到來(lái)前就已成熟，不會(huì)因?yàn)榻涤陮?dǎo)致裂果或大量落果。因此，適合發(fā)展櫻桃種植業(yè)，種植出來(lái)的櫻桃在市場(chǎng)上深受廣大消費(fèi)群體的喜愛(ài)，具有很大的競(jìng)爭(zhēng)力[1]。

2 研究方法

2.1 病害的調(diào)查

該研究的樣本主要在櫻桃癌腫病病害發(fā)生明顯的樹(shù)木枝干部分上進(jìn)行采集。病害標(biāo)本采集后，置于黑色塑料袋內(nèi)密封保存，同時(shí)記載病害采集日期和地點(diǎn)、采集人姓名。將采集后的標(biāo)本統(tǒng)一帶回實(shí)驗(yàn)室，并放置于4℃的冰箱內(nèi)保存，以便于接下來(lái)對(duì)病原菌進(jìn)行觀察、分離、純化以及病原菌鑒定等步驟。此次調(diào)查采用踏查的方法，于2020 年冬季對(duì)病害發(fā)生較為嚴(yán)重的昆明市祿勸縣做進(jìn)一步的了解。采取分級(jí)調(diào)查的方式調(diào)查病害的發(fā)生情況，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)[2]。

2.2 病原菌的鑒定

通過(guò)對(duì)采集的病害標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、形態(tài)學(xué)鑒定、病原菌的分離培養(yǎng)和純化[3]、革蘭氏染色及油鏡鏡檢[4]、病原菌的鑒定等步驟確定病原菌種類。

2.2.1 病害癥狀的觀察

觀察病害時(shí)（見(jiàn)圖1），需要注意病害的形狀、色澤等。此外，借助放大鏡和解剖顯微鏡進(jìn)行病害病癥的觀察，最好對(duì)病害癥狀拍攝照片并對(duì)其加注簡(jiǎn)明而準(zhǔn)確的描述。

圖1 野外采集的病害枝干Fig.1 Diseased Branches Collected in the Field Identification

2.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

（1）徒手切片：挑選病癥明顯的標(biāo)本進(jìn)行切片，好的切片要薄且透明、要有完整的組織結(jié)構(gòu)。

（2）鏡檢：將切好的切片置于載玻片上，滴一滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，先用低倍鏡觀察，看到切片組織后調(diào)到高倍鏡觀察（見(jiàn)圖2）。

圖2 形態(tài)學(xué)鑒定Fig.2 Morphological

（3）鑒定：結(jié)合病癥病狀，宏觀與微觀的形態(tài)特征，查閱相關(guān)資料進(jìn)行分析。

2.2.3 病原菌的分離培養(yǎng)和純化

（1）病原菌的分離：采用分離法對(duì)病菌進(jìn)行分離培養(yǎng)（見(jiàn)圖3），將分離出的病菌放置于LB 培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。

圖3 分離培養(yǎng)的菌落Fig.3 Isolated and Cultured Colonies Colonies

（2）病原菌的純化和保存：在37℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3d～5d 后待到培養(yǎng)基長(zhǎng)出明顯的單個(gè)菌落，在無(wú)菌條件下挑選出明顯的單個(gè)菌落于LB 平板上劃線進(jìn)行純化培養(yǎng)（見(jiàn)圖4）。制作試管斜面（見(jiàn)圖5）：配置好的LB 培養(yǎng)液注入試管，約每支管的1/3體積，在滅菌后斜放于超凈工作臺(tái)中。在無(wú)菌條件下將LB 平板菌株的純菌落中挑取菌落接入試管斜面中劃線保存。實(shí)驗(yàn)完畢后將純化的平板和斜面置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿試管的斜面后置于4℃冰箱凍存。

圖4 純化培養(yǎng)的菌落Fig.4 Purified Cultured

圖5 試管斜面Fig.5 In Vitro Cant

2.2.4 革蘭氏染色及油鏡鏡檢

選擇生長(zhǎng)試管斜面進(jìn)行革蘭氏染色反應(yīng)并在100 倍油鏡下鏡檢（見(jiàn)圖6、圖7）。

圖6 革蘭氏染色反應(yīng)Fig.6 Gram Staining eaction

圖7 100 倍油鏡下觀察到的染色菌體Fig.7 Chromosome Seen under 100x Oil Lens

2.2.5 病原菌的鑒定

該研究主要以分子鑒定為主。其步驟按照細(xì)菌基因組DNA 試劑盒中文說(shuō)明進(jìn)行：

（1）將純化培養(yǎng)出來(lái)的菌種取1ml～5ml 放入離心管中，向菌體沉淀中加入200μl 緩沖液GA，將離心管放在渦漩儀上振蕩至菌體徹底懸浮。

（2）向管中加入20μl Proteinase K 溶液，混勻。

（3）向上述離心管中加入220μl 的緩沖液GB，振蕩15s，70℃放置10min，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

（4）向上述離心管中加入220μl 的無(wú)水乙醇，充分振蕩15s 以混勻?qū)嶒?yàn)材料，若此時(shí)出現(xiàn)絮狀沉淀，放入離心機(jī)中離心30s 以去除管壁內(nèi)的水珠。

（5）將上述所得溶液和絮狀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（～13400×g）離心1min，倒掉廢液，將吸附柱CB3 放入收集管中。

（6）向吸附柱CB3 中加入500μl 緩沖液GD（使用前先檢查是否加入無(wú)水乙醇），12000rpm（～13400×g）離心1min，然后倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管。

（7）向吸附柱CB3 中加入600μl 漂洗液PW（使用前先檢查是否加入無(wú)水乙醇），12000rpm（～13400×g）離心1min，倒掉廢液，將吸附柱CB3 放入收集管中。

（8）重復(fù)操作步驟7。

（9）將吸附柱CB3 放回收集管中，12000rpm（～13400×g）離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3 置于室溫下放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

（10）將吸附柱CB3 轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附模的中間部位懸空滴加50ul 洗脫緩沖液TE，室溫?cái)R置2min～5min，12000rpm（～13400×g）離心2min，將液體收集到離心管中。

注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μl，體積過(guò)小影響回收率，洗脫液的pH 值對(duì)于洗脫效率有很大的影響。若用ddH2O 做洗脫效液應(yīng)保證其PH 值在7.0～8.5 范圍內(nèi)，pH 值低于7.0 會(huì)降低洗脫效率；且DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防止DNA 降解。為增加基因組DNA 的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3 中，室溫放置2min，12000rpm（×g）離心2min。

（11）進(jìn)行PCR 反應(yīng)[5]，反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系Tab.1 PCR Amplification Reaction System

PCR 擴(kuò)增條件：

（12）電泳：首端BM 2000 DNA Marker，后面樣本，點(diǎn)樣孔朝向負(fù)極，各4μl，90v，電流最大，拍照（凝膠：體積25ml，濃度1%（瓊脂糖0.25g，TAE 緩沖液25ml（為防止揮發(fā)加30ml）TAE 緩沖液：1000ml/50倍濃度）（見(jiàn)圖8）。

圖8 PCR 跑膠Fig.8 PCR Run Glue

（13）測(cè)序。

（14）比對(duì)：測(cè)序DNA 序列用序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 病害調(diào)查情況

3.1.1 昆明市祿勸縣櫻桃癌腫病調(diào)查情況昆明市祿勸縣櫻桃樣地調(diào)查情況

表2 櫻桃癌腫病樣地調(diào)查情況Tab.2 Sample Site Investigation of Cherry Wart Disease

發(fā)病率=68.75%

從以上數(shù)據(jù)了解到，調(diào)查的昆明市祿勸縣櫻桃癌腫病發(fā)病率和病情指數(shù)分別為68.75%、28.13%，可以得出結(jié)論，調(diào)查的樣地發(fā)病率和病情指數(shù)都很高。

3.1.2 昆明市祿勸縣櫻桃癌腫病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

通過(guò)建立指標(biāo)遞階層次表，分層構(gòu)造指標(biāo)判斷矩陣，比較各層組內(nèi)的指標(biāo)重要性，對(duì)各指標(biāo)數(shù)值進(jìn)行賦值，選出15 個(gè)指標(biāo)作為林業(yè)有害生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)櫻桃癌腫病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估得出每個(gè)指標(biāo)的權(quán)重如表3。

表3 櫻桃癌腫病風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系[6]Tab.3 Index System of Cherry Wart Disease Risk Analysis

目標(biāo)層準(zhǔn)則層Pij有害生物風(fēng)險(xiǎn)綜合評(píng)價(jià)值R受害寄主經(jīng)濟(jì)重要性P4=2.5指標(biāo)層Pij受害寄主的類P41=0.05受害寄主的分布面積或產(chǎn)量P42=2.0受害寄主的特殊經(jīng)濟(jì)價(jià)值P43=2.5危險(xiǎn)性管理難度P5=2.5333檢疫識(shí)別的難度P51=2.0除害處理的難度P52=2.8根除的難度P53=2.8權(quán)重等權(quán)等權(quán)

3.1.3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)體系量化計(jì)算公式及風(fēng)險(xiǎn)分析等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)

表4 風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系采用的量化計(jì)算公式Tab.4 Table of Quantitative Calculation Formulas Adopted by Risk Analysis Index System

表5 櫻桃癌腫病風(fēng)險(xiǎn)分析等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)Tab.5 Classification Standard for Risk Analysis of Cherry Wart Disease

通過(guò)計(jì)算得到風(fēng)險(xiǎn)綜合評(píng)價(jià)值R=2.4367，屬于高度危險(xiǎn)程度，需要引起相關(guān)部門的重視，并作出相應(yīng)的預(yù)防治療措施。

3.2 形態(tài)鑒定結(jié)果

觀察病害組織外觀時(shí)發(fā)現(xiàn)病癥處粗糙并龜裂，可輕輕將瘤狀物掰掉，瘤狀物呈現(xiàn)環(huán)狀出現(xiàn)在枝干部病，并且病部病癥無(wú)霉?fàn)钗?，結(jié)合病害組織宏觀和微觀特征說(shuō)明此種病害屬于細(xì)菌性畸形病。

3.3 分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及植物表面滅菌效果

根據(jù)觀察表6，了解到處理1min 后菌落生長(zhǎng)最好，單個(gè)菌落數(shù)量最多。2min～3min 菌落生長(zhǎng)數(shù)量較多，4min～5min 幾乎無(wú)菌落生長(zhǎng)。說(shuō)明處理1min、2min 瘤體消毒效果好的同時(shí)又不至于殺死需要的病原菌，在分離病原菌的時(shí)候選擇處理1min 和2min 瘤體是最好的，能最大程度下保留想要獲得的病原菌。

表6 分離培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)菌落生長(zhǎng)個(gè)數(shù)情況Tab.6 Table of Growth Number of Isolated and Cultured Experimental Colonies

3.4 革蘭氏染色和油鏡鏡檢結(jié)果

對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色反應(yīng)后在100 倍油鏡下用光學(xué)顯微鏡觀察到菌體呈現(xiàn)為紅色，說(shuō)明此種病原菌為革蘭氏陰性菌。

3.5 DNA 送檢以及序列比對(duì)的結(jié)果

1#送檢后獲得的堿基序列：

1#多重序列對(duì)比：經(jīng)過(guò)測(cè)序公司對(duì)送檢樣進(jìn)行測(cè)序，得到的序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)得到結(jié)果如下。

進(jìn)一步分析致病菌的16S rDNA 序列結(jié)果表明，該菌株與Agrobacterium tumefaciens （登錄號(hào)為KP050793.1）同源性最高，并且與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的Agrobacterium tumefaciens（登錄號(hào)為KP050793.1）的相似度達(dá)到了99%。綜合兩者的結(jié)果進(jìn)行分析，初步判斷引起祿勸櫻桃癌腫病的病原菌為Agrobacterium tumefaciens。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

綜上所述，引起昆明市祿勸縣櫻桃癌腫病的病原菌是薄壁菌門瘤菌科農(nóng)桿菌屬及致瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）。屬于好氧菌，菌體桿狀，大小1μm～3μm×0.4μm～0.8μm，鞭毛周生，有1～4 根鞭毛，革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢，能形成莢膜。只有攜帶Ti 質(zhì)粒的菌株才具有致病性，Ti 質(zhì)粒同時(shí)還控制對(duì)細(xì)菌素的抗感性和寄主范圍。Ti 質(zhì)粒可以用熱處理或其他因素丟失，使細(xì)菌失去致病力。

4.2 討論

4.2.1 侵染循環(huán)

據(jù)昆明市祿勸縣癌腫病病害年年發(fā)病并且有增長(zhǎng)的趨勢(shì)及病原菌的生活習(xí)性可知，此病原菌存在侵染循環(huán)（包括初次侵染、再次侵染、傳播媒介、越冬場(chǎng)所）。

（1）初次侵染：病菌主要通過(guò)傷口侵入，隨后氣溫的升高和降雨的增多，到6～8 月份開(kāi)始大面積的發(fā)病。

（2）再次侵染：在適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度18℃～22℃時(shí)，尤其是在降水偏多的6～8 月份，適合癌瘤的形成和發(fā)展，是病害爆發(fā)的高峰時(shí)期。

（3）傳播媒介：癌腫病病菌通過(guò)風(fēng)、雨水、病殘?bào)w、蟲(chóng)類、嫁接工具、作業(yè)農(nóng)具等進(jìn)行傳播，帶病種苗和種條調(diào)運(yùn)帶菌是遠(yuǎn)距離傳播的重要途徑。

（4）越冬場(chǎng)所：病菌主要在病瘤內(nèi)或土壤和土壤中的寄主殘?bào)w內(nèi)越冬。

4.2.2 發(fā)病規(guī)律春季是櫻桃采摘的季節(jié)，采摘過(guò)程中造成莖桿的損傷，易導(dǎo)致病菌侵入，而春季病害發(fā)生較少，沒(méi)有引起種植戶的重視，一般都沒(méi)有進(jìn)行病害防治，為夏季病害的大爆發(fā)提供了條件。夏季6 月～8 月溫暖潮濕，特別是昆蟲(chóng)活動(dòng)頻繁易造成此病大爆發(fā)，病害的傳播速度最快，是一年當(dāng)中發(fā)病率最高的時(shí)期，是病害防治過(guò)程中的重點(diǎn)防治時(shí)期。秋季櫻桃生長(zhǎng)緩慢并趨于停止，抗病能力較強(qiáng)，病害的發(fā)生同樣較少。冬季病原菌在腫瘤內(nèi)越冬，是來(lái)年病害發(fā)生的侵染源，然而種植戶冬季并沒(méi)有及時(shí)進(jìn)行病株、病葉的清理，是導(dǎo)致來(lái)年發(fā)病更嚴(yán)重的主要原因。

4.3 綜合防治

通過(guò)對(duì)櫻桃癌腫病病害的調(diào)查、侵染循環(huán)、發(fā)病規(guī)律的研究得出綜合防治方案。在防治時(shí)，使用綜合防治方案進(jìn)行科學(xué)的、合理的防治，處理好病害系統(tǒng)中各種因數(shù)之間的相互關(guān)系，櫻桃癌腫病的防治要遵照預(yù)防為主，綜合防治為輔的準(zhǔn)則：主要包括農(nóng)業(yè)技術(shù)措施、物理機(jī)械防治和化學(xué)藥劑防治。