劉金養(yǎng)，吳雅倩，李 娟，涂攀峰，陳杰忠，姚 青

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院廣州，510642；2 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院，廣州，510642)

白柿(CasimiroaedulisLlave & Lex)，別名冰淇淋果、墨西哥蘋果，屬蕓香科香肉屬，為常綠中型喬木。原產(chǎn)于墨西哥和中美洲等地，現(xiàn)世界各地都有引種栽培[1-2]。果實富含維生素C，具有較高的營養(yǎng)與藥用價值[3]。白柿果實可直接食用，冷凍后風(fēng)味更佳，也可加工成果汁、果醬、果凍、餅干、調(diào)味料、冰淇淋、酸酪乳及蜜餞等食品[4]。果實具有安眠及減輕風(fēng)濕痛功效，西班牙人喝由其葉做成的茶，可降低血壓[5]。白柿有一定的抗旱性及耐鹽堿性[6]，具有豐產(chǎn)、易栽培、病蟲害少等優(yōu)點[7]。白柿在我國作為新興水果進(jìn)行商業(yè)栽培也是近幾年才開始的，在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)主栽品種“W4”白柿存在花量大但著果少，成果率低的問題。初步的觀測研究表明：“W4”白柿落果嚴(yán)重，可能是由于其花藥發(fā)育不全而花粉含量少，造成無法授粉受精而大量落果，即使在一些配置了授粉樹或人工異花授粉的情況下，后期的生理落果也很嚴(yán)重。

果樹生理落果的原因有很多，其中果實發(fā)育過程中的碳水化合物及內(nèi)源激素含量變化與其落果密切相關(guān)。有研究表明，柚早期落果是由于樹體養(yǎng)分不足進(jìn)而造成供給果實發(fā)育的碳水化合物不足導(dǎo)致的，脫落果中的碳水化合物比留存果低[8]。在荔枝的果實生長發(fā)育過程中，糖饑餓會促進(jìn)脫落酸和乙烯的合成，進(jìn)而抑制生長素的合成以及生長素的極性運(yùn)輸，從而導(dǎo)致幼果脫落[9]。蘋果果實脫落與ABA通過刺激氣孔關(guān)閉促進(jìn)乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)傳遞到離區(qū)，進(jìn)而在離區(qū)轉(zhuǎn)化為乙烯從而激活離區(qū)造成脫落有關(guān)[10]。碳水化合物及內(nèi)源激素對果實脫落的作用在柑桔、荔枝、蘋果、棗樹、梨等多種果樹上都已有報道[8-12]。但是，還未見過白柿果實生長發(fā)育期間，碳水化合物和內(nèi)源激素對其落果影響的研究報道。本文以主栽品種“W4”白柿為材料，觀測了其生長發(fā)育期間的落果規(guī)律和果實生長動態(tài)，并分析了落果與正常發(fā)育果實中碳素水平和內(nèi)源激素的含量差異，為今后制定減少白柿生理落果和提高產(chǎn)量的技術(shù)措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在廣州市的華南農(nóng)業(yè)大學(xué)果園進(jìn)行，試材為自臺灣引種的“W4”白柿。選取生長勢一致的兩年生本砧“W4”白柿(CasimiroaedulisLlave & Lex cv.W4)10株進(jìn)行定點觀測，每株選擇不同方向的3個大枝條，定期觀察記錄果實與枝條的生長情況，并統(tǒng)計落果率。另選擇開花時間相近，生長狀況相似的5株白柿，將其中5個枝條的果實套上網(wǎng)袋，用于收集落果。果實生長發(fā)育期每隔20 d左右(2月26日、3月18日、4月7日、4月27日、5月17日)，收集網(wǎng)袋的落果，挑選出果皮完好、果柄青綠的近日脫落的落果，并在每株樹上采集2個無病害、處于相同生長發(fā)育期、大小相似的未脫落果實，樣品采集后立即放入干冰桶中帶回實驗室，保存于-80 ℃的冰箱備用。采集的樣品用于碳水化合物與內(nèi)源激素含量的測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 開花結(jié)果物候期調(diào)查 2020年8月1日選取生長勢一致的白柿10株進(jìn)行定點觀測，調(diào)查時間持續(xù)1年，調(diào)查現(xiàn)蕾期、花苞膨大期、初花期(全樹有5%花開放)、盛花期(25%～75%的花開放)、終花期(全部花已開放，并有部分花瓣開始脫落)、謝花期(大量落花至落花完畢)、著果期、果實膨大期、成熟期、抽梢、新梢停止生長等物候期。

1.2.2 落果率調(diào)查 選擇開花時間相近、生長狀況相似的5株白柿，從試驗樹的不同方位挑選3個枝條掛牌，進(jìn)行白柿果實發(fā)育動態(tài)的觀察，在白柿謝花后統(tǒng)計并記錄初始著果數(shù)，之后每隔10 d統(tǒng)計一次剩余果數(shù)直至果實采收，觀察并記錄著果的動態(tài)變化，果實橫、縱徑以及單果質(zhì)量。統(tǒng)計相對落果率(Relative abscission rate，RAR)與累積落果率(Accumulative abscission rate，AAR)。

其中，相對落果率(RAR)的計算按照如下公式：

RAR(%·d-1)=[(Xt-Xt-1)/Xt·d-1]×100

式中：Xt-1和Xt為相鄰兩個時期的存留果數(shù)，d為兩次觀測時間t和t-1的間隔天數(shù)。

累積落果率(AAR)的計算按照如下公式：

AAR=[(X0-Xt)/X0]×100%

式中：X0為初始著果數(shù)量，Xt為時間t時的著果數(shù)量。

1.2.3 果實發(fā)育動態(tài)調(diào)查 自謝花后，選取同一時期生長狀態(tài)一致的白柿果實10個進(jìn)行標(biāo)記，每隔10 d測量5個果實的縱、橫徑，直至果實采收。如果果實中途脫落，再從另5個果實中挑選發(fā)育相近的果實補(bǔ)充，繪制果實生長動態(tài)曲線圖。

1.2.4 碳水化合物的測定 可溶性總糖含量測定采用蒽酮比色法。提取待測液：稱取0.2 g果肉粉末置于10 mL離心管中，加入3 mL蒸餾水，90 ℃水浴鍋內(nèi)水浴加熱30 min，冷卻后8 000 rpm下離心5 min，重復(fù)兩次，之后合并上清液，定容至25 mL。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液(100 mg·mL-1)，稀釋成6個梯度濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、10、20、60、80和100 mg·mL-1)，各吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和2.5 mL蒽酮試劑，混勻后90 ℃水浴鍋內(nèi)加熱15 min，冷卻后測量625 nm處OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測定：吸取0.1 mL糖提取液，加入0.9 mL蒸餾水和2.5 mL蒽酮試劑于90 ℃水浴鍋內(nèi)加熱15 min后，測量625 nm處OD值。計算：可溶性總糖含量=經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的總糖濃度(μg·mL-1)×樣品稀釋后的體積(mL)/稱取的果肉質(zhì)量(g)/106×100%。

1.2.5 果實內(nèi)源激素含量的測定 采用Waters公司的超高效液相三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Xevo UPLC-TQD-MS)作為定量檢測儀器。植物內(nèi)源激素含量所需色譜和質(zhì)譜條件參數(shù)設(shè)定如下：

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；錐孔氣流50 L·h-1；倍增器電壓650 V；碰撞氣(氬氣)0.17 L·h-1；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；詳細(xì)質(zhì)譜設(shè)置參數(shù)見表1。

表1 內(nèi)源激素質(zhì)譜參數(shù)

將GA3、IAA、tZ、ABA和ACC標(biāo)準(zhǔn)品用80%甲醇溶解，配成標(biāo)準(zhǔn)母液待用，再用80%甲醇稀釋7種標(biāo)準(zhǔn)母液，配成1 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品，上機(jī)進(jìn)行質(zhì)譜調(diào)諧，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物調(diào)諧結(jié)果設(shè)定最優(yōu)參數(shù)(毛細(xì)管電壓、源溫、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流速、錐孔氣流、錐孔電壓、碰撞電壓)。后期對流動相及配比、洗脫方式、洗脫時間、流速大小等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最優(yōu)液相條件。

色譜條件：使用Waters公司XBridgeTMBEH C18色譜柱(3.0 mm×75 mm，2.5 μm)；流動相A：0.1%(V/V)甲酸-水溶液；流動相B：0.1%(V/V)甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

液液萃取外標(biāo)法依照鹿源生物公司植物內(nèi)源激素試劑盒中的前處理方法。步驟如下：取凍干后樣品約0.05 g，加入500 μL提取液(異丙醇混合溶劑)；加入2顆鋼珠，研磨機(jī)研磨2 min；-20 ℃放置20 min，冰浴中超聲30 min；加入1 mL氯仿，-20 ℃放置20 min，冰浴中超聲5 min，渦旋振蕩1 min，離心5 min(4 ℃，13 000 rpm)，取下層溶液0.9 mL于EP管，氮吹儀吹干后加入0.2 mL甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，上機(jī)。

外標(biāo)法根據(jù)植物內(nèi)源激素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜定性離子片段和出峰保留時間對樣品中的內(nèi)源激素進(jìn)行定性，先根據(jù)外標(biāo)準(zhǔn)曲線計算檢測樣品植物激素的濃度，再根據(jù)以下公式計算單位鮮質(zhì)量內(nèi)源激素含量：

內(nèi)源激素含量(ng·g-1FW)=目標(biāo)物濃度(μg·mL-1)×最終上機(jī)體積(μL)/樣品鮮質(zhì)量(g)

2 結(jié)果與分析

2.1 開花結(jié)果物侯期調(diào)查

觀測結(jié)果表明，兩年生本砧“W4”白柿在廣州市天河區(qū)現(xiàn)蕾期12月10—22日，花苞膨大期1月3—17日，初花期1月20—24日，盛花期1月25—31日，2月1—5日進(jìn)入終花期，2月6—10日謝花期，謝花后果實開始發(fā)育，3月中旬出現(xiàn)第一次落果高峰，4月中旬出現(xiàn)第二次落果高峰，5月下旬出現(xiàn)采前落果，果實在5—6月成熟采收(見表3)。

表3 “W4”白柿開花結(jié)果物候期

2.2 白柿果實脫落規(guī)律

“W4”從謝花后至成熟采收前有3次明顯的落果高峰期，其中第一次生理落果期在謝花后40 d左右，第二次生理落果期在謝花后70 d左右，采前落果在謝花后110 d左右。第二次落果高峰期持續(xù)時間較短，且只有一個小增長高峰(見圖1)。在經(jīng)歷了3次落果高峰后，白柿果量約為每枝1～2個，顯著低于白柿記錄的正常產(chǎn)量。從落果量來看，單株果樹標(biāo)記的5個果穗的總落果數(shù)量高達(dá)92個。第一次落果高峰期的大量落果是造成白柿產(chǎn)量低的重要因素。對這一時期落果的果實進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)落果果實未形成種子，授粉受精失敗是形成第一次落果高峰期的主要原因。

圖1 白柿的相對落果率與累積落果率

2.3 果實生長發(fā)育動態(tài)

“W4”白柿果實縱徑與橫徑變化如圖2所示?！癢4”白柿果實生長曲線符合單“S”型生長曲線，即生長初期果實緩慢增長，中期果實快速生長，生長末期果實生長趨于平緩直至果實成熟?！癢4”白柿自謝花后至謝花后50 d果實生長緩慢，生長初期果實平均每日增長量0.46 mm。謝花后50 d果實開始快速生長，至謝花后100 d，平均每日增長量0.66 mm。謝花后100～140 d進(jìn)入生長末期，平均每日增長量0.12 mm。

圖2 白柿果實生長發(fā)育期縱、橫徑變化

2.4 落果與正常發(fā)育果實碳水化合物含量的差異

如圖3所示，正常果及脫落幼果的可溶性總糖含量總體上均表現(xiàn)為上升趨勢。正常果的可溶性總糖含量在整個試驗期間均高于脫落幼果。其中在謝花后的第40 d，差異最顯著，正常果的可溶性總糖含量為67.50 mg·g-1FW，比落果高14.26%。

注：*表示在0.05水平差異顯著；**表示在0.01水平差異顯著；***表示在0.001水平差異顯著(t-test，n=5)。圖4至圖9同。

2.5 落果與正常發(fā)育果實內(nèi)源激素含量的變化差異

2.5.1 赤霉素(GA3) 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的GA3含量差異顯著。如圖4所示，正常發(fā)育與脫落幼果在果實發(fā)育期間，GA3含量變化趨勢大致相同，均呈先上升后下降再上升的趨勢。在此期間，正常發(fā)育果實GA3含量始終高于脫落果實，且均呈顯著差異，在謝花后第60 d正常發(fā)育果實中GA3含量達(dá)到最高值，兩者差異最顯著，此時正常發(fā)育果實GA3含量達(dá)251.19 ng·g-1FW，是脫落果實的26.17倍。正常果實的GA3含量在第20～60 d呈上升趨勢，第60～80 d急速下降，第80 d達(dá)到最低值，第80～100 d緩慢上升。脫落果實的GA3含量在第20～40 d呈上升趨勢，第40～80 d呈下降趨勢，第80 d達(dá)到最低值，隨后開始回升，并于第100 d達(dá)到最高值，此時脫落果實的GA3含量為38.50 ng·g-1FW。以上結(jié)果表明，落果期GA3含量對白柿保果起著重要作用，推測在落果前需補(bǔ)充一定量赤霉素，其中謝花后第60 d及第100 d前進(jìn)行補(bǔ)充可能會起到較好的效果。

圖4 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的GA3含量

2.5.2 生長素(IAA) 如圖5所示，白柿正常發(fā)育與脫落幼果的IAA含量在不同時期呈先下降再上升的趨勢。在謝花后第20～60 d正常發(fā)育果實中IAA含量顯著高于脫落果實，在第20 d正常發(fā)育果實中IAA含量為最高值，兩者差異最顯著，此時正常發(fā)育果實IAA含量達(dá)65.88 ng·g-1FW，是脫落果實的3.59倍。第60～80 d正常發(fā)育果實中IAA含量急劇下降，此時正常發(fā)育果實的IAA含量顯著低于脫落果實。第80～100 d IAA含量開始回升，最終正常發(fā)育果實IAA含量高于脫落幼果，但兩者沒有顯著差異。脫落果實的IAA含量在第20～60 d呈下降趨勢，第60 d達(dá)到最低值，隨后開始回升，并于第100 d達(dá)到最高值，此時脫落果實的IAA含量為65.88 ng·g-1FW。以上結(jié)果表明，白柿第一次大量落果時期的正常果與落果IAA含量存在較大的差異，其中第一次落果高峰前差異最顯著。

圖5 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的IAA含量變化

2.5.3 玉米素(tZ)含量的變化差異 白柿正常發(fā)育與脫落幼果的tZ含量在不同時期呈先上升后下降再上升的趨勢。二者在謝花后第40 d達(dá)到各自的最高值，正常果實是脫落果實的3.79倍，二者差異顯著，隨后兩者tZ含量急速下降，正常果實tZ含量的下降幅度高于落果，第80 d達(dá)到最低值，第80～100 d小幅回升。試驗期間，正常發(fā)育果實的tZ含量始終高于落果(見圖6)。以上結(jié)果表明，第一次及第三次落果期的正常果與落果tZ含量存在較大差異，其中，第一次落果高峰后連續(xù)20 d里，落果的tZ含量均顯著低于正常果。

圖6 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的tZ含量變化

2.5.4 脫落酸(ABA)含量的變化差異 白柿脫落幼果ABA含量在不同時期呈總體上升趨勢，而正常發(fā)育果實總體呈下降趨勢。在謝花后第40～100 d，脫落果實ABA含量顯著高于正常發(fā)育果實。在第100 d時脫落果實ABA含量達(dá)到最高值，而正常發(fā)育果實ABA含量達(dá)到最低值，此時的脫落果實ABA含量為2 398.12 ng·g-1FW，是正常發(fā)育果實的27.56倍(見圖7)。上述結(jié)果表明，在果實發(fā)育的整個時期里，大部分時間脫落果的ABA含量高于正常果，高質(zhì)量濃度的ABA可能是造成果實脫落的主要因素。

圖7 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的ABA含量變化

2.5.5 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)含量的變化差異 如圖8所示，白柿果實發(fā)育不同時期，脫落幼果的ACC含量始終高于正常發(fā)育果實。在謝花后第20～100 d脫落幼果的ACC含量呈現(xiàn)波浪形趨勢，在第60 d達(dá)到最高值(191.99 ng·g-1FW)，顯著高于正常發(fā)育果實，是正常發(fā)育果實的6.23倍。正常發(fā)育果實ACC含量呈先下降再上升趨勢，第20～40 d正常發(fā)育果實ACC含量急劇下降，第40～80 d下降速度變緩，第80～100 d呈上升趨勢。這表明，落果與正常果ACC含量的差異可能是造成果實脫落的因素。值得注意的是，ACC與GA3含量在一些時期呈現(xiàn)相反的趨勢，推測二者在果實脫落過程中起著相反的作用。

圖8 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的ACC含量變化

2.5.6 白柿正常果和脫落果的內(nèi)源激素比值變化 果實生長發(fā)育期間白柿正常果和脫落果中(ABA+ACC)/(GA3+IAA+tZ)之值的變化曲線如圖9所示。從中可知，在整個果實發(fā)育期內(nèi)脫落果中內(nèi)源激素的比值顯著高于正常果，正常果中的激素比值曲線變化平穩(wěn)，而脫落果的內(nèi)源激素比值曲線呈先短暫下降而后又急劇上升再下降的總趨勢。在謝花后的第20～60 d即第一次生理落果期間，脫落果中的內(nèi)源激素的比值呈緩慢下降后又急劇上升的變化趨勢；謝花后的第60～100 d即第二次生理落果期間，落果中的內(nèi)源激素的比值又開始呈下降趨勢。但第二次生理落果階段(ABA+ACC)/(GA3+IAA+tZ)之值遠(yuǎn)高于第一次生理落果階段的比值，這一變化規(guī)律表明，生長促進(jìn)物質(zhì)(GA3、IAA、tZ)和生長抑制物質(zhì)(ABA+ACC)的彼此消長對白柿不同發(fā)育階段的落果現(xiàn)象影響顯著。

圖9 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的內(nèi)源激素比值變化

3 討論

由于“W4”白柿花藥發(fā)育不全而花粉含量少，嚴(yán)重阻礙了其自然授粉，生產(chǎn)上多采用配置授粉樹或人工授粉的方法以保證其充分授粉，但其后期的生理落果仍對白柿產(chǎn)量造成重要影響。糖作為植物生長的能量和碳骨架來源，在調(diào)節(jié)植物器官脫落的過程中起著重要作用。有研究表明，荔枝落果中低水平的碳水化合物是誘導(dǎo)其脫落的第一信號，該信號傳遞至脫落部位，從而影響各類植物激素的平衡，進(jìn)而誘導(dǎo)果實脫落[13]。在白柿果實發(fā)育期間，發(fā)現(xiàn)正常果的可溶性總糖含量顯著高于脫落幼果，說明正常果具有較強(qiáng)的營養(yǎng)富集能力，維持了果實正常發(fā)育所需的營養(yǎng)，保證了果實內(nèi)部的激素穩(wěn)態(tài)平衡，防止了果實脫落。

植物內(nèi)源激素的細(xì)微變化會影響果實生長發(fā)育，通常乙烯與脫落酸含量增加會促進(jìn)果實脫落，而果實內(nèi)的生長促進(jìn)激素(IAA、GA3、ZT)則有利于著果和果實發(fā)育[14-15]。有關(guān)研究表明，荔枝果實中的內(nèi)源ABA高峰值的出現(xiàn)時間與其落果高峰期對應(yīng)[16]。蘋果的生理落果是由于其種子和果肉中的生長促進(jìn)物質(zhì)合成量少，在量上不足以拮抗由果旁葉在一定季節(jié)內(nèi)向果肉中輸入與脫落相關(guān)的生長抑制物質(zhì)所致[17]。本研究中，白柿正常果的赤霉素(GA3)和玉米素(tZ)高于脫落幼果，而脫落幼果中的抑制生長激素脫落酸(ABA)和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)顯著高于正常果。推測低水平的GA3和高水平的ABA可能是誘導(dǎo)白柿果實脫落的主要因素。而脫落果中的(ABA+ACC)/(GA3+IAA+tZ)之值顯著高于正常果，正常果的比值始終處于相對平穩(wěn)狀態(tài)，而脫落果的比值呈上下波動變化，表明果實中抑制生長與促進(jìn)生長的兩類激素比值對白柿生理落果有著重要的調(diào)控作用。

4 結(jié)論

“W4”白柿在廣州地區(qū)種植表現(xiàn)出的開花物候期是從1月下旬至2月初，整個花期約為16 d。果實生長發(fā)育過程中存在3次落果高峰，分別在3月中旬、4月中旬及5—6月，果實的生長符合單“S”型生長曲線。白柿果實發(fā)育期間的生理落果嚴(yán)重程度是影響其產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。在這一時期正常果的可溶性總糖含量顯著高于脫落幼果，而正常果的赤霉素(GA3)和玉米素(tZ)高于脫落幼果，其脫落幼果中的抑制生長激素脫落酸(ABA)和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)顯著高于正常果，同時脫落果中的(ABA+ACC)/(GA3+IAA+tZ)的比值顯著高于正常果。依據(jù)其內(nèi)源植物激素缺乏狀況，進(jìn)而補(bǔ)充相關(guān)外源植物激素可能對減少白柿生理落果具有一定效果。