劉友接，王建超，熊月明

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，福州，350013)

花粉是植物系統(tǒng)發(fā)育中的保守器官，也是植物攜帶遺傳信息的雄性生殖細(xì)胞，其形態(tài)特征受基因控制，受外界環(huán)境條件的影響較小，具有較強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性、可靠性和保守性[1-4]。種子植物的成熟花粉有其獨(dú)特的形態(tài)特征，包括花粉大小、形狀、萌發(fā)孔數(shù)量及位置、花粉表面紋飾等，這些穩(wěn)定的保守性狀可為植物系統(tǒng)分類、進(jìn)化分析和物種起源提供依據(jù)[2-4]。運(yùn)用掃描電鏡觀察花粉的形態(tài)特征并進(jìn)行鑒定和系統(tǒng)分類在果樹遺傳學(xué)研究領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，如李[5]、楊梅[6]、榛[7]、番荔枝[8]、樹莓[9]、火龍果[10]、荔枝[11]、橄欖[12]、桃[13-17]、枇杷[18-19]、蘋果[20-21]、山杏[22]、櫻桃[23]等。黃皮Clausenalansium(Lour.)Skeels是蕓香科(Rutaceae)黃皮屬的熱帶亞熱帶常綠小喬木，素有“果中之寶”的美稱，是藥食同源果樹，原產(chǎn)于我國(guó)華南地區(qū)，至今有1 500多年栽培歷史。福建省是我國(guó)黃皮主產(chǎn)區(qū)之一，其黃皮種質(zhì)歷經(jīng)長(zhǎng)期自然變異、人工選擇育種和馴化栽培，種質(zhì)資源十分豐富。目前，鮮見有關(guān)黃皮花粉超微形態(tài)特征觀察研究報(bào)道。本試驗(yàn)以福建省不同黃皮產(chǎn)區(qū)的33份種質(zhì)花粉為研究材料，運(yùn)用掃描電鏡研究其形態(tài)結(jié)構(gòu)，以花粉性狀數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用聚類分析方法對(duì)33份種質(zhì)進(jìn)行分類，旨在為黃皮種質(zhì)資源的系統(tǒng)分類鑒定提供孢粉學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年4月，在福建省11個(gè)黃皮生產(chǎn)點(diǎn)選擇農(nóng)藝性狀差異較大的33份黃皮種質(zhì)資源，即晉安01，來自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所；晉安02、晉安03、晉安04，來自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所龍眼資源圃；晉安05、晉安06、晉安07、晉安08、晉安09，來自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海峽現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園；云霄02、云霄03、云霄04、云霄05，來自福建省云霄縣東廈鎮(zhèn)竹塔村；薌城01，來自福建省漳州市薌城區(qū)琥珀小路2號(hào)；閩侯01、閩侯02、閩侯03、閩侯04、閩侯05、閩侯06，來自福建省閩侯縣白沙鎮(zhèn)大目埕村；羅源01、羅源02，來自福建省羅源縣起步鎮(zhèn)港頭村；羅源03、羅源04、羅源05、羅源06、羅源07，來自福建省羅源縣鳳山鎮(zhèn)城關(guān)村；福安01、福安02、福安03，來自福建省福安市穆陽鎮(zhèn)蘇堤村；福清01，來自福建省福清市音西街道蘆院村；福清02、福清03，來自福建省福清市東張鎮(zhèn)瀨底村。

每份種質(zhì)各選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的實(shí)生結(jié)果老樹1株，在黃皮植株外圍中上部健壯結(jié)果枝發(fā)育良好、花藥飽滿的花序上，選取含苞待放花蕾，掰開花瓣，采集花藥，待花藥開裂后收集花粉于指形管內(nèi)，用5%戊二醛固定，5 ℃左右低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

花粉用5%戊二醛固定4 h，磷酸緩沖液清洗3次，每次間隔10～15 min；經(jīng)1%鋨酸固定4 h，用蒸餾水清洗3次，每次間隔10～15 min；用50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐級(jí)脫水，每次間隔10～15 min，其中用100%乙醇置換3次；自然干燥；用離子濺射儀(型號(hào)：EIKO IB-5)進(jìn)行噴金，讓黃皮花粉表面鍍上一層金膜；運(yùn)用JSM-6380LV型掃描電子顯微鏡觀察，分別選取代表性視野觀察花粉群體形態(tài)特征(放大800倍)、單個(gè)花粉形態(tài)特征(放大3 500倍)、花粉赤道面中部的外壁表面紋飾特征(放大8 000倍)，并進(jìn)行照相和記錄。在Smile view軟件下測(cè)量花粉表面網(wǎng)眼密度、極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、萌發(fā)溝長(zhǎng)度及寬度，計(jì)算極軸長(zhǎng)/赤道軸長(zhǎng)，每份資源測(cè)量花粉20粒?；ǚ坌螒B(tài)特征描述主要參考王伏雄等[1]、王開發(fā)等[2]、G·埃爾特曼[4]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 19.0軟件的離差平方和法進(jìn)行聚類分析，制作樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉大小與形狀

黃皮花粉為輻射對(duì)稱型，花粉粒極軸平均長(zhǎng)度為20.31 μm，赤道軸平均長(zhǎng)度為18.09 μm，極軸長(zhǎng)/赤道軸長(zhǎng)(P/E)平均值為1.13。其中，福清02花粉極軸最大，為23.76 μm，晉安06最小，為17.97 μm；福清01花粉赤道軸最大，為20.55 μm，羅源03和羅源06最小，為17.11 μm；福清02的P/E最大，為1.23，晉安06的最小，為1.01。按G·埃爾特曼的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]，黃皮花粉屬于小的級(jí)別(直徑10～25 μm)?；ǚ坌螤顬榻蛐?0.88

2.2 萌發(fā)溝

萌發(fā)溝是花粉的重要形態(tài)特征。黃皮花粉具孔溝，33份種質(zhì)絕大多數(shù)具有3條簡(jiǎn)單萌發(fā)溝和3個(gè)內(nèi)孔，溝順著極軸方向在赤道面上向兩個(gè)極端輻射，并呈等間距環(huán)狀分布，萌發(fā)溝相互間不交匯，有溝界極區(qū)，從極面觀可觀察到3條下凹的長(zhǎng)形溝，赤道面觀可觀察到1～2條，根據(jù)G·艾特曼的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]，黃皮花粉屬于赤道三溝類型(N3P4C3)。長(zhǎng)形溝，中段較寬，溝端漸尖，溝深淺不一，溝底膜上分布著數(shù)量不等、不規(guī)則形狀的顆粒凸起，外壁在溝邊緣不變薄。每條萌發(fā)溝均具有1個(gè)內(nèi)孔，頂端被孔膜蓋住，位于萌發(fā)溝中央，內(nèi)孔較大，形狀不一，縱長(zhǎng)高出外壁，內(nèi)孔與溝相交，溝中的3個(gè)內(nèi)孔在赤道面上呈等距離的環(huán)狀分布，孔的形狀呈現(xiàn)多樣性。其中，孔呈四方形的有閩侯01、閩侯02、閩侯05、閩侯06、福清01、福清03、云霄04、云霄05、福安01、福安02、福安03、晉安02、晉安08、晉安09、羅源01、羅源07、薌城01，孔呈近圓形的有羅源02、閩侯03、閩侯04、云霄03、晉安01，孔呈橢圓形的有羅源04、云霄02、晉安05，孔呈三角形的有晉安07，其余的均呈不規(guī)則形狀。

不同種質(zhì)萌發(fā)溝的長(zhǎng)度、寬度及溝內(nèi)凸起顆粒數(shù)量有差異。萌發(fā)溝平均溝長(zhǎng)16.90 μm、平均溝寬2.98 μm；晉安03的萌發(fā)溝最長(zhǎng)，為19.34 μm，薌城01最短，為14.84 μm；晉安02的萌發(fā)溝最寬，為3.92 μm，閩侯04最窄，為2.40 μm。不同種質(zhì)花粉萌發(fā)溝內(nèi)凸起顆粒多的種質(zhì)有閩侯06、云霄04、晉安08、閩侯02、云霄02等，顆粒少的種質(zhì)有羅源03、羅源05、羅源06、羅源07、閩侯03等。

2.3 花粉外壁紋飾

黃皮花粉外壁表面具有網(wǎng)狀雕紋，由隆起的脊條相連接，組成多邊形或不規(guī)則形狀的網(wǎng)眼和脊洼，網(wǎng)脊寬窄不一，脊面較光滑，網(wǎng)眼大小不一，穿孔，呈漏空狀，脊洼不穿孔，深淺不一。花粉表面平均網(wǎng)眼密度1.47個(gè)/μm2，福清01密度最大，為2.15個(gè)/μm2，晉安09密度最小，為0.95個(gè)/μm2。黃皮花粉表面紋飾復(fù)雜，不同種質(zhì)花粉外壁紋飾因網(wǎng)眼密度、大小、穿孔多少、脊洼多少及深淺等形態(tài)變化不一，可大致分為3種類型：一類為網(wǎng)眼密度小，網(wǎng)狀，網(wǎng)脊隆起，寬窄不均，脊面較光滑，網(wǎng)眼為多邊形或不規(guī)則形狀，較小，大小不一，密度小，穿孔少，脊洼多，較淺，如晉安09、晉安03等。二類為網(wǎng)眼密度中等，網(wǎng)狀，網(wǎng)脊隆起，寬窄不均，脊面較光滑，網(wǎng)眼為多邊形或不規(guī)則形狀，較小，大小不一，密度中等，穿孔較多，脊洼較少，較淺，如晉安04、羅源07等。三類為網(wǎng)眼密度大，網(wǎng)狀，網(wǎng)脊隆起，寬窄不均，脊面較光滑，網(wǎng)眼為多邊形或不規(guī)則形狀，孔較小，大小不一，密度大，穿孔多，脊洼少，較淺，如福清01、晉安06等(見表1、圖1至圖3)。

表1 33份黃皮種質(zhì)花粉粒形態(tài)指標(biāo)比較

圖1 晉安01等11份黃皮種質(zhì)花粉形態(tài)

圖2 晉安07等11份黃皮種質(zhì)花粉形態(tài)

圖3 閩侯02等11份黃皮種質(zhì)花粉形態(tài)

2.4 聚類分析

聚類分析結(jié)果看出，在等級(jí)結(jié)合線L1遺傳距離為10處可將33份黃皮種質(zhì)分為3類：第1類包括羅源03、羅源05、羅源06、羅源07、閩侯03、閩侯04、晉安02、晉安06、福安03、薌城01等10份種質(zhì)，代表種質(zhì)羅源05。基本形態(tài)特征是極軸、赤道軸均較短，均值分別為18.80、17.55 μm，花粉粒相對(duì)較??；極軸長(zhǎng)/赤道軸長(zhǎng)較小，為1.08；萌發(fā)溝最短，為16.29 μm，寬度中等，為2.92；表面網(wǎng)眼密度較大，為1.59個(gè)/μm2，外壁紋飾網(wǎng)狀，網(wǎng)脊隆起，寬窄不均，脊面較光滑，網(wǎng)眼為多邊形或不規(guī)則形，孔大，大小不一，穿孔多，脊洼少，較淺。

第2類包括閩侯01、閩侯02、閩侯06、福清03、云霄02、云霄04、福安01、福安02、晉安05、晉安07、晉安08、晉安09、羅源01、羅源02、羅源04等15份種質(zhì)，代表種質(zhì)閩侯01?；拘螒B(tài)特征是極軸、赤道軸長(zhǎng)度中等，均值分別為20.44、17.85 μm，花粉粒大小中等，極軸長(zhǎng)/赤道軸長(zhǎng)較大，為1.15；萌發(fā)溝長(zhǎng)度中等，為17.12，寬度最大，為3.10 μm；表面網(wǎng)眼密度最小，為1.40個(gè)/μm2，外壁紋飾網(wǎng)狀，網(wǎng)脊隆起，寬窄不均，脊面較光滑，網(wǎng)眼為多邊形或不規(guī)則形，較小，大小不一，穿孔較多，脊洼較多，較淺。

第3類包括云霄03、云霄05、閩侯05、晉安01、晉安03、晉安04、福清01、福清02等8份種質(zhì)，代表種質(zhì)晉安01?；拘螒B(tài)特征是極軸、赤道軸均較長(zhǎng)，均值分別為21.98、19.21 μm，花粉粒較大；極軸長(zhǎng)/赤道軸長(zhǎng)較大，為1.15；萌發(fā)溝最長(zhǎng)，為17.25 μm，寬度最窄，為2.83 μm；表面網(wǎng)眼密度中等，為1.44個(gè)/μm2，外壁紋飾網(wǎng)狀，網(wǎng)脊隆起，寬窄不均，脊面較光滑，網(wǎng)眼為多邊形或不規(guī)則形，孔較小，大小不一，穿孔多，脊洼少，淺。

在等級(jí)結(jié)合線L2遺傳距離約15處可將33份種質(zhì)分為2大類，其中第1類與第2類聚成一個(gè)類群，第3類聚成另一類群(見圖4)，可見，第3類與第1類、第2類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。說明黃皮花粉形態(tài)特征差異能夠很好地反映種質(zhì)間的親緣關(guān)系。

圖4 基于花粉粒性狀的33份黃皮種質(zhì)資源聚類分析

3 結(jié)論與討論

運(yùn)用掃描電鏡對(duì)33份黃皮種質(zhì)花粉的超微形態(tài)特征進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，33份種質(zhì)花粉的形態(tài)特征相對(duì)較一致，單粒，表面具有3條萌發(fā)溝和3個(gè)孔，溝順著極軸方向延伸，從極面觀可觀察到3條，赤道面觀可觀察到1～2條，屬于赤道3溝類型花粉；溝長(zhǎng)形，溝底膜上分布著數(shù)量不等、不規(guī)則形狀的顆粒凸起，外壁在溝邊緣不變??；孔位于溝的中央，頂端被孔膜蓋住，孔較大，高出外壁，內(nèi)孔與溝相交；花粉外壁表面具有網(wǎng)狀雕紋，由隆起的脊條相連接，組成多邊形或不規(guī)則形的網(wǎng)眼和脊洼。說明這些黃皮種質(zhì)親緣關(guān)系較近，符合植物傳統(tǒng)分類學(xué)中種類同質(zhì)性的論斷。

不同黃皮種質(zhì)的花粉大小，形狀，萌發(fā)溝長(zhǎng)度、寬度，凸起顆粒數(shù)量及外壁紋飾等超微形態(tài)特征上差異明顯，形態(tài)特征多樣性?；ǚ圯^大的種質(zhì)有福清02、閩侯05等，花粉較小的種質(zhì)有晉安06、羅源03、羅源06等；花粉近球形或長(zhǎng)球形，極面觀呈3裂圓三角形或3裂近圓形，赤道面觀近圓形或橢圓形等，表面網(wǎng)狀雕紋復(fù)雜等。這可能與黃皮種質(zhì)資源來自不同產(chǎn)區(qū)的實(shí)生樹、長(zhǎng)期自然變異、種質(zhì)分布區(qū)域、頻繁異地引種活動(dòng)及人工育種等諸多因素有關(guān)。孢子花粉外壁紋飾是細(xì)分孢粉屬種的重要特征之一[2]，也有將花粉表面紋飾稱作為品種(系)的“指紋”[24]。根據(jù)花粉表面網(wǎng)眼密度可大致分為網(wǎng)眼密度小、網(wǎng)眼密度中等、網(wǎng)眼密度大等3種類型。黃皮花粉外壁紋飾特征可為鑒別種質(zhì)間的進(jìn)化關(guān)系提供重要證據(jù)?；ǚ哿Ｐ螒B(tài)特征由內(nèi)部基因控制，受外界條件影響較小，具有較強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性[1-2]。黃皮傳統(tǒng)形態(tài)分類受外界生長(zhǎng)環(huán)境影響較大，而花粉粒形態(tài)特征是在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中不斷演化和發(fā)展形成的，攜帶大量遺傳演化信息，在黃皮種質(zhì)鑒定和系統(tǒng)分類方面，孢粉學(xué)研究具有重要意義；但僅憑孢粉學(xué)鑒定不夠全面，必須與果樹形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)以及生物化學(xué)等研究結(jié)果結(jié)合起來，相互補(bǔ)充，全面分析，方可得出更為準(zhǔn)確的結(jié)論。

花粉形態(tài)是每個(gè)果樹種質(zhì)獨(dú)具的微觀特征，可為種質(zhì)親緣關(guān)系分析、種質(zhì)鑒定和系統(tǒng)分類提供依據(jù)[10]。本試驗(yàn)聚類分析結(jié)果表明，在遺傳距離為10水平上，33份黃皮種質(zhì)可分為3類，為黃皮種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系研究提供了孢粉學(xué)證據(jù)。本研究?jī)H從孢粉學(xué)方面對(duì)黃皮種質(zhì)進(jìn)行了分類，不同種質(zhì)花粉形態(tài)特征與其植物學(xué)性狀等方面的相關(guān)性尚待進(jìn)一步研究。