任可心，蔣景龍，陽 妮，王 倩，王國軍，李 麗，丁德寬

(1 陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中，723001；2 漢中市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣與培訓(xùn)中心，陜西漢中，723000；3 城固縣果業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站，陜西漢中，723200)

酸橙(CitrusaurantiumL.)為蕓香科柑桔屬植物，一般枝條硬且多具針刺，葉片狹長，翼葉較大，葉柄較長，果實(shí)趨于扁圓形，果皮粗糙易剝離，中心柱多為空虛，酸度極高[1]。原產(chǎn)于亞歐大陸東南部，我國為主要起源地，主要栽培于湖北、江西、浙江、四川和湖南等省，具有獨(dú)特的風(fēng)味和較高的營養(yǎng)價(jià)值，可被用于加工香料、果汁和膳食營養(yǎng)補(bǔ)充劑。傳統(tǒng)中藥中的枳實(shí)和枳殼主要由用酸橙及其栽培變種的果實(shí)制成?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，酸橙具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌和防止動(dòng)脈粥樣硬化等功效[2]。酸橙變異豐富，在柑桔類屬系統(tǒng)分類中占有極其重要的地位，是柑桔遺傳進(jìn)化研究和種質(zhì)資源創(chuàng)新與改良的重要材料。此外，酸橙具有根系發(fā)達(dá)、樹齡長、抗逆性強(qiáng)、積累特殊次生代謝物等特征，是寶貴的柑桔材料，且受到人工選擇的影響較小，保存著珍貴的遺傳多樣性，在柑桔育種以及開發(fā)應(yīng)用等方面具有廣闊的發(fā)展前景。

多倍體是指含有3套或3套以上完整染色體組的生物體，在自然界中廣泛存在，很多重要的作物比如小麥、土豆、甘蔗和棉花都是多倍體[3]。多倍體可以是異源多倍體或同源多倍體，分別可通過2n配子有性繁殖或體細(xì)胞染色體加倍產(chǎn)生，同源多倍體基因組由相同的染色體組組成，通常起源于種內(nèi)雜交，而異源四倍體基因組由不同的亞基因組組成，通常起源于不同物種之間的種間雜交[4-5]。大量研究證明，多倍體對(duì)逆境的耐受能力強(qiáng)，更能適應(yīng)環(huán)境的變化，在進(jìn)化中占優(yōu)勢(shì)。比如四倍體的枳、薯蕷、水稻和大翼橙等，具有更強(qiáng)的抵抗干旱[6]、低溫[7]、高溫[8]及鹽脅迫[9-11]的能力。因此，柑桔多倍體種質(zhì)資源的挖掘可為提高柑桔非生物脅迫能力的研究提供參考，具有重要的意義和價(jià)值。選育四倍體的方式有很多種，例如秋水仙素誘導(dǎo)、實(shí)生篩選、體細(xì)胞融合等[12]。由于柑桔部分珠心胚可自發(fā)進(jìn)行染色體加倍，柑桔2n配子發(fā)生的頻率較高且較普遍，所以實(shí)生篩選是目前獲得柑桔四倍體的主要方法。梁武軍等[13]從10個(gè)柑桔砧木實(shí)生后代中發(fā)掘自然發(fā)生的四倍體，表明從珠心胚實(shí)生系中尋找同源四倍體是一條可行、有效的途徑。周銳等[14]基于根系特征、葉片特征和油胞等形態(tài)特征進(jìn)行篩選，從6個(gè)多胚性二倍體柑桔品種發(fā)掘出72株四倍體后代。筆者參考前人的方法，利用陜西漢中獨(dú)特的酸橙資源進(jìn)行了四倍體材料篩選研究。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

酸橙果實(shí)(圖1)于2020年10月25日由陜西省漢中市城固縣果業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站在城固縣原公鎮(zhèn)垣山村(北緯33°09′24″、東經(jīng)107°20′00″)同一株樹上采集。剝?nèi)〔⒔y(tǒng)計(jì)酸橙果實(shí)內(nèi)的種子，然后在0.5 mol/L NaOH溶液中搓洗10～15 min，去除種子表面的果膠，再用0.2 mol/L次氯酸鈉溶液消毒3～5 min，清水洗凈后選取飽滿種子剝除種皮，將種子放入45 ℃水浴鍋中催芽3～4 h。將催芽后的種子移至營養(yǎng)土(泥炭∶珍珠巖=3∶1，體積比)中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度4 000 lx，光照周期16 h/8 h(白天/夜間)，溫度(25±2)℃。

圖1 酸橙果實(shí)與種子

1.2 多倍體鑒定

1.2.1 形態(tài)初選 待酸橙幼苗長至5～6片真葉時(shí)(約需5個(gè)月)，根據(jù)周銳等[14]的形態(tài)篩選法(與二倍體相比，四倍體植株表現(xiàn)出主根變短、直徑變粗，須根數(shù)量減少，葉片顏色加深，葉片顯著變厚，葉形指數(shù)變小，油胞密度降低等)對(duì)酸橙幼苗進(jìn)行初步篩選，并進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。

1.2.2 染色體計(jì)數(shù) 參考LAN等[15]的根尖染色體壓片法，對(duì)疑似四倍體進(jìn)行染色體觀察。首先切取1 cm根尖并用流水涮去表面土壤，之后在飽和對(duì)二氯苯溶液中預(yù)處理2 h，在卡諾固定液中固定2 h，在1 mol/L HCL中酸解1 min(60 ℃水浴)，20%卡寶品紅溶液染色，壓片，最后在萊卡顯微鏡下檢測染色體數(shù)目并拍照。

1.3 SSR(Simple Sequence Repeat)分子標(biāo)記鑒定

采集二倍體和四倍體的葉片，參照新型快速植物基因組DNA提取試劑盒——離心柱型(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)技術(shù)流程，分別提取基因組DNA，取部分DNA提取液用滅菌的ddH2O稀釋至100 ng/μL且4 ℃?zhèn)溆?，剩余DNA提取液置于-20 ℃冰箱凍存。試驗(yàn)所用SSR引物(見表1)參考李益等[16]，由上海Sangon公司合成。PCR反應(yīng)總體系為20 μL：模板DNA 2 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 10 μL(蘇州近岸蛋白科技有限公司)，10 μmol/L正向引物2 μL，10 μmol/L反向引物2 μL，滅菌ddH2O 4 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，總共32個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

表1 SSR引物序列

PCR完成后的處理，參照謝小燕等[17]的方法并做適當(dāng)改動(dòng)。取2.5 μL PCR產(chǎn)物，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓150 V)約2 h 10 min后進(jìn)行銀染，最后用Epson Expression 10000XL影像掃描儀采集圖像。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

1.4.1 生長性狀觀察 以同一時(shí)期培養(yǎng)的二倍體為對(duì)照組，觀察四倍體植株的生長狀況。用直尺測量株高、葉長和葉寬，葉形指數(shù)=葉長/葉寬。在燈光照射下，統(tǒng)計(jì)葉片上表皮1 cm2范圍內(nèi)的油腺(油胞)個(gè)數(shù)，計(jì)算油胞密度。

1.4.2 葉片氣孔觀察 參照Oustric等[18]的方法，對(duì)四倍體及其二倍體的葉片氣孔大小和密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在同時(shí)期的二倍體、四倍體植株上，選取同一節(jié)位處的葉片，將其切成小塊狀，在電子掃描顯微鏡下觀察葉片下表皮的氣孔形態(tài)特征，以保衛(wèi)細(xì)胞的長度和橫徑作為氣孔的長度和橫徑，每次觀察10個(gè)視野，重復(fù)3次，測得氣孔長度、氣孔寬度以及氣孔密度(個(gè)/mm2)。

1.4.3 葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察 參考付盼等[19]的石蠟切片法，觀察四倍體和二倍體的葉片解剖結(jié)構(gòu)。摘取四倍體和二倍體的葉片，清洗干凈后用剪刀剪去葉子兩邊，留下主脈附近，再剪幾個(gè)大小合適的方形葉片，于FAA(Formalin-acetic acid-alcohol)固定液中固定24 h，番紅染色液染色48 h，脫水透明后包埋，凝固后修塊。用HESTION-ERM3100半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)切片，切片在36 ℃烘箱中烘12 h，然后進(jìn)行脫蠟透明和番紅固綠染色處理，最后中性樹膠封片保存。在Nikon ECLIPSE E600顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根尖細(xì)胞染色體觀察

根據(jù)形態(tài)學(xué)初步觀察，從1 620株酸橙實(shí)生苗中篩選出了疑似四倍體32株，再根據(jù)根尖染色體計(jì)數(shù)法最終篩選獲得7株酸橙四倍體，酸橙四倍體群體的自然發(fā)生率為0.43%。酸橙二倍體根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目為18條，四倍體根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目為36條(見圖2)。

注：a：二倍體；b：四倍體

2.2 SSR分子標(biāo)記鑒定分析

以二倍體為對(duì)照，用3對(duì)引物對(duì)篩選的四倍體進(jìn)行分子鑒定的結(jié)果表明，四倍體植株的擴(kuò)增條帶與二倍體植株的擴(kuò)增條帶完全一致(見圖3)?？梢?，酸橙四倍體均可能是由二倍體植株珠心胚自然加倍而來的同源四倍體。

注：1～3酸橙二倍體，4～10酸橙四倍體。

2.3 植株形態(tài)學(xué)觀察

觀察結(jié)果表明，四倍體植株生長緩慢，植株明顯矮化，株高僅為二倍體的71%；四倍體植株的主根粗、側(cè)根少，葉片相較于二倍體植株更濃綠、更寬圓。二倍體植株平均葉長和葉寬為7.38 cm和2.22 cm，四倍體植株平均葉長和葉寬為5.53 cm和2.7 cm。四倍體植株葉片表現(xiàn)為變短變寬，從而導(dǎo)致葉形指數(shù)變小，僅為二倍體葉片的61%。酸橙四倍體和二倍體葉片下表皮的氣孔大多數(shù)呈現(xiàn)為橢圓形或者近圓形。四倍體葉片氣孔大于二倍體，氣孔長度是二倍體葉片的1.41倍，氣孔寬度是二倍體的1.40倍；氣孔密度和油胞密度相比較于二倍體極顯著(p<0.01)降低，分別為二倍體的54.9%和30.6%。可見，相較于二倍體，四倍體的葉片氣孔顯著增大，氣孔密度顯著減小(見圖4和表2)。

注：a：整株；b：根；c：葉片；d：二倍體油胞；e：四倍體油胞；f：二倍體氣孔；g：四倍體氣孔。

表2 酸橙二倍體與同源四倍體植株部分形態(tài)參數(shù)的比較

2.4 葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察

用石蠟切片法對(duì)酸橙二倍體和四倍體進(jìn)行葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察。葉片主脈橫切結(jié)果顯示，二倍體和四倍體的葉片主脈均呈不規(guī)則半圓形，四倍體葉片主脈突出較二倍體明顯，表明四倍體葉片主脈較二倍體更發(fā)達(dá)。薄壁細(xì)胞(Pa)位于維管束外側(cè)，四倍體的薄壁細(xì)胞面積明顯大于二倍體。與二倍體相比，四倍體葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度均極顯著(p<0.01)增大，分別增加了44%、32%、36%、64%和37%。四倍體的海綿組織間隙較二倍體大。此外，四倍體葉片的柵海比、葉片結(jié)構(gòu)緊密度和葉片結(jié)構(gòu)疏松度分別是二倍體的1.21、1.13和0.94倍(見圖5和表3)。

表3 酸橙二倍體與同源四倍體植株葉片解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

注：a、b：酸橙二倍體葉片；c、d：酸橙四倍體葉片。2x：二倍體；4x：四倍體；UE：上表皮；LE：下表皮；ST：海綿組織；PT：柵欄組織；Ph：韌皮部；X：木質(zhì)部；Pa：薄壁細(xì)胞。

3 討論

植物經(jīng)過多倍化后往往表現(xiàn)出比親本二倍體更強(qiáng)的抗寒、抗旱、抗鹽堿能力[20]，因此人們已經(jīng)將多倍體育種視為提高植物抗逆性的有效手段。目前已知獲得多倍體的方法有秋水仙素誘導(dǎo)、體細(xì)胞融合、實(shí)生選種等。秋水仙素誘導(dǎo)多倍體這種方法是有效的，并被報(bào)道在各種植物中誘導(dǎo)獲得了多倍體；然而，此方法較耗時(shí)，并經(jīng)常產(chǎn)生嵌合體。體細(xì)胞雜交也是一種可用于獲得多倍體的技術(shù)，但需要高水平的專業(yè)知識(shí)，而且效率非常低，并受到原生質(zhì)體再生能力的限制。由于柑桔多數(shù)品種具有多胚性且珠心細(xì)胞存在自然加倍現(xiàn)象，所以柑桔實(shí)生選種是一種有效選育多倍體的一種方法，并且實(shí)生選種具有操作方便、無污染和無毒性等特點(diǎn)[21-23]。柑桔多倍體往往與二倍體有一些形態(tài)學(xué)差異，比如根粗、葉片寬圓、葉色濃綠等，根據(jù)這些形態(tài)特征結(jié)合根尖染色體壓片法篩選可快速獲得四倍體植株。本研究通過形態(tài)初選，從酸橙的1 620株群體實(shí)生苗中獲得了32株疑似四倍體植株，再經(jīng)根尖染色體壓片方法篩選，最終確定了7株為四倍體，形態(tài)初選成功率為21.87%，群體四倍體自然發(fā)生率為0.43%。使用3對(duì)多態(tài)性SSR引物對(duì)由飽滿種子獲得的酸橙四倍體植株來源進(jìn)行SSR鑒定，結(jié)果表明四倍體的帶型與其二倍體親本完全一致，說明多胚性酸橙種子中形成的四倍體來自珠心細(xì)胞染色體的自然加倍。

植物體多倍化后往往會(huì)發(fā)生各種各樣的生物學(xué)特性變化，比如器官具有巨大性[24]。在本研究中，酸橙四倍體植株相比較于二倍體植株明顯矮化、主根粗短、葉片寬圓、葉色濃綠等。這種形態(tài)特征變化與王雨亭等[25]和蔣景龍等[26]的研究結(jié)果相似(四倍體新余蜜桔和四倍體衢州香橙植株相較于各自的二倍體植株，在根和葉上都表現(xiàn)出了巨大性)。因此，根據(jù)四倍體與二倍體植株的形態(tài)差異進(jìn)行初步篩選是一種快速且有效的方法。

細(xì)胞的巨大性是區(qū)別植物多倍體和二倍體的重要指標(biāo)之一，氣孔增大、氣孔密度下降是多倍體的典型特征。該特征已經(jīng)普遍應(yīng)用于蘋果[27]、桑樹[28]、梨[29]等植物多倍體鑒別。在本研究中，酸橙四倍體與二倍體相比，葉片氣孔大小與密度都有極顯著差異。

多倍體植物一般會(huì)表現(xiàn)出葉片增厚、變大的趨勢(shì)[30]。在本研究中，四倍體酸橙葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度都極顯著大于二倍體，這與張丞慧等[31]在新疆野蘋果四倍體和二倍體上的研究結(jié)果一致。目前普遍認(rèn)為柵欄組織與海綿組織厚度比(P/S)和葉片結(jié)構(gòu)緊密度(CTR)可作為植株抗逆性的重要指標(biāo)。劉婉秋等[32]以丹參為材料，研究發(fā)現(xiàn)丹參三倍體的P/S和CTR相比較于二倍體都顯著增大，具有更強(qiáng)的光合作用能力和防止水分蒸騰的能力，抗旱性更強(qiáng)。韓淑華等[33]研究發(fā)現(xiàn)，四倍體桑品種陜桑402-1的P/S和CTR都極顯著大于其同源二倍體親本新一之瀨，并且進(jìn)一步利用隸屬函數(shù)分析法得出陜桑402-1的抗旱性高于新一之瀨。在本研究中，酸橙四倍體的P/S和CTR極顯著大于二倍體，表明酸橙四倍體的抗逆性相比于二倍體更強(qiáng)。這對(duì)于柑桔育種來說有非常重要的意義。

酸橙長久以來被廣泛應(yīng)用于寬皮桔類和甜橙的砧木。本研究根據(jù)植株主根短、葉片寬圓、葉色濃綠和油胞密度減少等形態(tài)特征進(jìn)行初步篩選，再利用根尖染色壓片法篩選，從酸橙1 620株群體實(shí)生苗中篩選得到7株四倍體植株。這對(duì)酸橙種質(zhì)資源的發(fā)掘，尤其是抗逆性更強(qiáng)的優(yōu)良柑桔砧木的選育有重要意義。