段蓉蓉，周錚榮，韓 健，羅旭釗，馬先鋒，李大志，鄧子牛

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/國家柑桔改良中心長沙分中心，長沙，410128；2 湖南省園藝研究所，長沙，410125)

柑桔作為世界第一大水果，為縮短童期和保持品種特性，在生產(chǎn)上多采用嫁接方式進(jìn)行繁殖。砧木既影響著柑桔的抗性與適應(yīng)性[1]，還影響著柑桔的生長發(fā)育、果實產(chǎn)量與品質(zhì)等[2]。柑桔生長的最適土壤pH值范圍為5.5～6.5[3]，土壤過酸或過堿都會對柑桔生長造成嚴(yán)重阻礙。根據(jù)全國土壤調(diào)查結(jié)果，我國土壤pH值范圍在3.7～9.7，主要集中在4.5～9.0范圍內(nèi)，近1/3的土壤pH值在8.0～8.5之間[4]。在我國柑桔主產(chǎn)區(qū)中，四川和重慶等地的土壤呈堿性，其他大多數(shù)地區(qū)土壤呈酸性，其中，湖南省甜橙主產(chǎn)區(qū)由于長期過量施用化肥，84.6%的柑桔園土壤pH值低于4.8，最低達(dá)到了2.8，土壤酸化十分嚴(yán)重[5]。因此，選擇和培育耐酸堿性強的砧木已經(jīng)成為柑桔產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要需求。

枳Poncirustrifoliata是柑桔砧木中應(yīng)用最廣、綜合評價最好的砧木。在我國，北到河北、山東，南至廣東、廣西均有枳的分布，并且在長期的栽培和自然演變過程中形成了豐富的枳屬資源。枳具有很強的適應(yīng)性，具有耐寒、耐酸等優(yōu)點，但易感裂皮病和碎葉病[6]。枳雖耐酸，其生長適宜的pH值范圍卻為5.5～6.5，這制約了枳在中性或偏堿性土壤中的應(yīng)用[7]，同時，土壤過酸也會對枳的生長產(chǎn)生不利影響，故生產(chǎn)上多采用枳橙或枳柚等雜種進(jìn)行替代。酸橙Citrusaurantium和香橙Citrusjunons與枳同為常用柑桔砧木。酸橙根系發(fā)達(dá)，樹勢強，耐鹽堿，耐土傳病害，抗逆性強，易感衰退病[8]。香橙適宜生長的土壤pH值范圍廣，具有耐鹽堿的特點[9-10]。

為了篩選出耐酸堿、具半矮化特性以及不易感病的優(yōu)良枳種質(zhì)，筆者以酸橙和香橙為耐堿對照，在溫室無土栽培條件下，比較了供試7份枳種質(zhì)對土壤酸堿的敏感性，并檢測其在酸堿脅迫下抗柑桔潰瘍病的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

從湖南省園藝研究所高橋基地、國家柑桔改良中心長沙分中心和湖南省邵陽市洞口縣大田村等地采集了7份枳種質(zhì)的種子，以酸橙、硬枝香橙和軟枝香橙為耐堿對照。其中，洞口枳來源于湖南省邵陽市洞口縣大田村，河南枳來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，富民枳、小葉枳、墨西哥飛龍枳、美國飛龍枳和變異枳均來源于湖南省園藝研究所高橋基地，硬枝香橙和軟枝香橙均來源于重慶市江津區(qū)白沙鎮(zhèn)，酸橙來源于國家柑桔改良中心長沙分中心。

1.2 方法

1.2.1 幼苗培養(yǎng)及處理 使用濕潤毛巾包裹新鮮的成熟種子，放入溫度為30 ℃、濕度為90%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中催芽。當(dāng)種子萌發(fā)出1 cm左右長度的主根時，選取正常發(fā)育的幼苗移栽到無菌培養(yǎng)土(商用育苗基質(zhì)，湖南湘暉農(nóng)科)中，在溫度為30 ℃、濕度為60%的溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。

當(dāng)幼苗生長20 d后，選取長勢基本一致的幼苗移栽至珍珠巖基質(zhì)中，一株一杯(0.6 L)，幼苗分別用pH值3、6和9的1/2 MS營養(yǎng)液進(jìn)行澆灌。營養(yǎng)液由1/2 MS培養(yǎng)基(不含糖和瓊脂)粉末(杭州百思)溶于蒸餾水中配置而成，使用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值，用pH計測定pH值。每10 d澆灌一次營養(yǎng)液，每次每株澆灌150 mL。每個處理9株，設(shè)置單株小區(qū)，9次重復(fù)。在酸堿處理一定時間后，測量株高、莖粗、葉片葉綠素含量，以及接種柑桔潰瘍病菌(Xanthomonascitrisubsp.citri，Xcc)后測定其對柑桔潰瘍病的抗性。

當(dāng)幼苗生長20 d后，另外選取12～15株生長一致的幼苗，將其根部分別浸入pH值3、6和9的1/2 MS營養(yǎng)液中，于溫室中培養(yǎng)24 h后，取葉樣和根樣測定抗氧化酶活性。

1.2.2 株高與莖粗的生長量測定 在酸堿處理第10 d、第40 d和第70 d時，分別測量植株高度(從基質(zhì)表面到頂端生長點的高度)和莖粗(距離基質(zhì)表面1.5 cm處主干的直徑)。株高和莖粗生長量均分早期和后期，早期株高(莖粗)生長量=處理第40 d時測量值-處理第10 d時測量值，后期株高(莖粗)生長量=處理第70 d時測量值-處理第40 d時測量值。

1.2.3 葉綠素含量測定 在酸堿處理第40天時，取頂端自上而下數(shù)第2—3片完全展開葉，剪成細(xì)長條狀(去除主葉脈)，稱取0.1 g裝入15 mL離心管中，加入95%乙醇10 mL，于黑暗中浸泡36 h(期間搖晃3～4次)后，使用酶標(biāo)儀分別測定浸泡液在470、649和665 nm波長處的吸光值(A)。每處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。測定結(jié)果計算式[11]如下：葉綠素a濃度(Ca，mg/L)=13.95A665-6.88A649，葉綠素b濃度(Cb，mg/L)= 24.96A665-7.32A649，總?cè)~綠素濃度(Car，mg/L)=(1 000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245，樣品葉綠體色素含量(mg/g)=(色素濃度×浸泡液體積×稀釋倍數(shù))/樣品鮮重。

1.2.4 抗氧化酶活性測定 幼苗根部分別浸入pH值3、6和9的1/2 MS營養(yǎng)液中溫室培養(yǎng)24 h后，剪取其頂端自上而下第1—3片完全展開葉，去除主葉脈后稱取0.1 g，同時剪取其根尖自下而上5 cm長度根系，稱取0.1 g，用液氮迅速冷凍。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定使用氮藍(lán)四唑光化還原法，過氧化物酶(POD)活性測定使用愈創(chuàng)木酚法[12-13]，可溶性蛋白使用試劑盒(美侖生物)進(jìn)行測定。每種處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 柑桔潰瘍病抗性測定 在酸堿處理第30天時，選頂端自上而下第1—3片完全展開葉進(jìn)行柑桔潰瘍病菌的注射接種。使用柑桔潰瘍病菌(Xcc)DL509菌系[14]，參考朱志媚等[15]的方法制備濃度為105CFU/mL的菌液，進(jìn)行活體注射接種，將菌液均勻注射進(jìn)葉片中，于溫度為28 ℃、濕度為30%的病理溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。在接種后8 d(8 DPI)統(tǒng)計單位葉面積的典型病斑數(shù)量，計算病情指數(shù)，劃分病癥級別。病情指數(shù)=該種質(zhì)的單位面積病斑數(shù)/病斑數(shù)最多種質(zhì)的單位面積病斑數(shù)。病癥級別劃分標(biāo)準(zhǔn)：1級(0<病情指數(shù)≤0.2)；2級(0.2<病情指數(shù)≤0.4)；3級(0.4<病情指數(shù)≤0.6)；4級(0.6<病情指數(shù)≤0.8)；5級(0.8<病情指數(shù)≤1)。

注射接種Xcc后，將材料放置在溫度28 ℃、濕度30%的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在注射后第4天、第6天和第8天使用打孔器在葉片相同位置取一枚面積為0.277 cm2的圓片，置于1.5 mL離心管中，加入500 μL無菌水和兩顆無菌小鋼珠，使用磨樣機(jī)將其震蕩成勻漿，按100倍比例進(jìn)行梯度稀釋，各濃度吸取10 μL點于LB平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計各濃度梯度的菌落數(shù)，計算原漿液的菌量，計算單位葉面積菌含量。每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。單位葉面積菌含量(CFU/cm2)=(x×50×100n-1)/0.277，x為在稀釋梯度平板中的菌落數(shù)(CFU)，n為稀釋梯度數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，采用Duncan法檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼苗生長發(fā)育

在相同pH值條件下，同一時期不同種質(zhì)幼苗之間的株高和莖粗生長量均有顯著性差異(見表1和表2)。

表1 在不同pH值處理下各柑桔砧木種質(zhì)幼苗早期株高和莖粗生長量

表2 在不同pH值處理下各柑桔砧木種質(zhì)幼苗后期株高和莖粗生長量

與適宜(pH值6)條件相比，酸(pH值3)處理早期(處理第10天至第40天)洞口枳、富民枳、墨西哥飛龍枳、美國飛龍枳、變異枳、硬枝香橙和酸橙的株高和莖粗生長均未受到抑制，后期(處理第40天至第70天)僅變異枳和軟枝香橙的株高和莖粗生長均未受到抑制；堿(pH值9)處理早期洞口枳、富民枳、墨西哥飛龍枳、美國飛龍枳、變異枳、硬枝香橙和酸橙的株高和莖粗生長均未受到抑制，后期僅軟枝香橙的株高和莖粗生長均未受到抑制。無論是酸處理還是堿處理，均是持續(xù)時間越長，抑制作用越明顯(見表1、表2)。在處理第70 天時，酸處理下洞口枳、河南枳、富民枳、小葉枳和變異枳出現(xiàn)頂端壞死(頂端生長點壞死，且靠近頂端生長點的葉片出現(xiàn)點狀或區(qū)域壞死)現(xiàn)象，飛龍枳未出現(xiàn)頂端壞死；堿處理下，僅河南枳出現(xiàn)頂端壞死(見圖1)。由此可知，酸脅迫對植株生長的抑制強于堿脅迫，且更易使新梢或芽點壞死，且隨著時間的推移，酸害程度逐漸加深。

圖1 部分柑桔砧木種質(zhì)幼苗在酸堿處理下出現(xiàn)頂端壞死

綜上所述，洞口枳、富民枳、墨西哥飛龍枳、美國飛龍枳和變異枳能耐受短期酸堿脅迫，變異枳還能耐受較長期的酸脅迫。

2.2 幼苗葉片葉綠素含量

從處理第40天時葉片黃化情況來看，枳種質(zhì)葉片對pH值變化敏感，堿處理更易使枳葉片出現(xiàn)黃化。其中，富民枳在pH值6處理下仍發(fā)生葉片黃化，這可能是其生長過于旺盛，而營養(yǎng)液提供的營養(yǎng)元素不足以供應(yīng)其生長導(dǎo)致的，同時也體現(xiàn)出富民枳對于土壤pH值的變化十分敏感的特征(見圖2)。這與處理第40天時葉綠素含量測定結(jié)果(見表3)基本一致。

圖2 不同pH值處理第40天時各柑桔砧木種質(zhì)葉片的黃化情況

與適宜(pH值6)條件相比，酸處理第40天時富民枳、小葉枳、硬枝香橙、軟枝香橙和酸橙的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均未受到不利影響，其他種質(zhì)的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均受到不利影響；堿處理第40天時富民枳、墨西哥飛龍枳、硬枝香橙、軟枝香橙和酸橙的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均未受到不利影響，其他種質(zhì)的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均受到不利影響。其中，河南枳、美國飛龍枳葉片葉綠素含量在酸脅迫受到的不利影響強于堿脅迫，洞口枳、小葉枳和變異枳葉片葉綠素含量在堿脅迫受到的不利影響強于酸脅迫(見表3)。

表3 不同pH值處理第40 天時各柑桔砧木種質(zhì)幼苗葉片的葉綠素含量 mg/g

綜上所述，富民枳幼苗葉片對酸脅迫和堿脅迫的敏感性均較低，小葉枳幼苗葉片對酸脅迫敏感性較低，墨西哥飛龍枳幼苗葉片對堿脅迫敏感性較低，河南枳、美國飛龍枳葉片對酸脅迫的敏感性高于堿脅迫，洞口枳、小葉枳和變異枳對堿脅迫的敏感性高于酸脅迫。

2.3 幼苗組織抗氧化酶活性

試驗結(jié)果表明，對洞口枳而言，酸堿處理下葉片的抗氧化酶活性均顯著高于pH值6處理，可溶性蛋白含量顯著下降，體現(xiàn)出洞口枳在酸堿脅迫下葉片抗性提高。此外，小葉枳在酸處理下葉片可溶性蛋白含量顯著增加、SOD活性顯著提高；硬枝香橙在酸處理下出現(xiàn)葉片CAT活性顯著下降，在堿處理下葉片SOD活性顯著增加；酸橙在酸處理下出現(xiàn)葉片CAT活性顯著增加(見表4)。

表4 在不同pH值處理下各柑桔砧木種質(zhì)葉片的抗氧化酶活性

與適宜(pH值6)條件相比，洞口枳根系可溶性蛋白含量、POD活性和CAT活性在堿處理下顯著增加，SOD活性在酸堿處理下均顯著減少，因此推測洞口枳根系在堿性環(huán)境中可能具有較強的活性氧清除能力與抗性。此外，富民枳、小葉枳、墨西哥飛龍枳、美國飛龍枳、硬枝香橙和酸橙根系SOD活性在酸處理下顯著增加，體現(xiàn)出其適應(yīng)酸性環(huán)境的特點；美國飛龍枳、軟枝香橙和酸橙根系POD活性在堿處理下顯著增加(見表5)。

表5 在不同pH值處理下各柑桔砧木種質(zhì)根系的抗氧化酶活性

2.4 幼苗柑桔潰瘍病抗性

接種Xcc后，各種質(zhì)的癥狀隨著時間的推移逐漸加重，在第6天時絕大數(shù)種質(zhì)即顯現(xiàn)癥狀，在第8天時所有種質(zhì)葉片的癥狀明顯。在第8天時，酸處理下的洞口枳、小葉枳和墨西哥飛龍枳，pH值6處理下的洞口枳和富民枳，堿性處理下的河南枳、美國飛龍枳、小葉枳和變異枳，病情指數(shù)在0～0.4之間，病癥級別為1～2級，感病相對較輕(見表6和表7)。

表6 在不同pH值處理下各柑桔砧木種質(zhì)接種柑桔潰瘍病菌(Xcc)后的癥狀表現(xiàn)

表7 在不同pH值處理下各柑桔砧木種質(zhì)接種柑桔潰瘍病菌后第8天的病情指數(shù)和病癥級別

與適宜(pH值6)條件相比，在接菌第4天時，富民枳和小葉枳葉片菌含量在酸處理下較少，河南枳葉片菌含量在堿處理下較少；在接菌第6天和第8天時河南枳和美國飛龍枳葉片菌含量在堿處理下較少，在第8天時墨西哥飛龍枳葉片菌含量在酸處理下較少。河南枳葉片菌含量在堿處理下持續(xù)8天保持較低，這表明在堿性環(huán)境下河南枳對Xcc可能具有相對較強的抗性。總體上，酸處理下的枳種質(zhì)葉片似乎比堿處理更適宜潰瘍病菌的增殖(見圖3)。

注：不同字母表示同一時間相同砧木不同pH值處理之間差異顯著(p<0.05)。

綜合葉片癥狀、病情指數(shù)和葉片菌含量數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷，墨西哥飛龍枳在酸性環(huán)境下以及河南枳和美國飛龍枳在堿性環(huán)境下對柑桔潰瘍病具有相對較強的抗性。

3 討論

在植株生長量上，不同柑桔砧木種質(zhì)之間具有明顯的差異，如：河南枳和飛龍枳的生長量小，這是其種質(zhì)特性所決定的，因此本試驗著重比較了同一種質(zhì)在不同pH值下的生長量差異，以此判斷酸堿環(huán)境對其生長的影響。本試驗僅對各柑桔砧木種質(zhì)幼苗在酸堿短期處理下的反應(yīng)進(jìn)行了研究，實際生產(chǎn)中土壤pH值對柑桔砧木和柑桔品種的影響是長期的，因此后續(xù)研究對各砧木開展評價需要延長時間，才能得到更加全面的認(rèn)識。

酸堿脅迫對柑桔砧木的生長和葉片形態(tài)的影響十分顯著。大量研究證明，酸脅迫影響植物的生理生化反應(yīng)，進(jìn)而影響礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收效率[16-17]；堿脅迫也會阻礙植物養(yǎng)分吸收，使其生長量和葉綠素含量下降[18]。在實際生產(chǎn)中，香橙與酸橙的生長勢大于枳，然而在本研究中，不同pH值處理下枳的生長量大于香橙和酸橙。這可能是由于本試驗中的砧木材料均為實生幼苗，對于枳幼苗而言，其在垂直方向上的生長勢較強，而酸橙和香橙主干較為粗壯，但生長勢較弱。

植物在受到酸堿脅迫時，內(nèi)部生理生化系統(tǒng)會受到不同程度的影響，從而產(chǎn)生大量活性氧(ROS)來應(yīng)對脅迫，而高抗氧化酶活性則是植物增加抗逆性的重要途經(jīng)[19]。同時，植物體內(nèi)的可溶性蛋白大多為參與各類代謝的酶類物質(zhì)，其含量在受到逆境脅迫時會發(fā)生相應(yīng)的變化以應(yīng)對逆境反應(yīng)[20]。在本研究中，各柑桔砧木種質(zhì)根和葉的可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性差異較大。值得注意的是，洞口枳在酸堿脅迫下葉片抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性和根系POD活性，堿脅迫下根系CAT活性，均相較對照(pH值6)有所增加，由此推測，洞口枳在生理生化方面對酸堿脅迫的耐性似乎強于其他種質(zhì)，而關(guān)于其耐酸堿的內(nèi)部機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

在柑桔砧木種質(zhì)耐酸堿性的評價中，還有一些其他指標(biāo)可用。例如：可溶性糖是植物在逆境條件下產(chǎn)生的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其濃度的高低可影響幼苗葉片的滲透勢，進(jìn)而影響幼苗的吸水能力；丙二醛含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度[21]；脯氨酸是一種良好的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有防止水分散失、保持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境滲透平衡的作用，有研究表明高堿脅迫會使水稻脯氨酸濃度升高[22]。此外，在逆境脅迫時，不同植物對營養(yǎng)元素的吸收和積累有所不同，進(jìn)而在葉片上表現(xiàn)出不同的受害癥狀，因此，研究柑桔砧木種質(zhì)葉片營養(yǎng)元素在不同pH值條件下的積累和變化可進(jìn)一步了解柑桔砧木種質(zhì)耐酸堿性的差異。柑桔砧木種質(zhì)的耐酸堿性是一個復(fù)雜的、受多因素影響的綜合性狀，評價其對酸堿脅迫的響應(yīng)也是一個復(fù)雜的過程，在后續(xù)的研究中應(yīng)進(jìn)行更加系統(tǒng)全面的分析與評價。

柑桔潰瘍病是由柑桔黃單胞桿菌柑桔亞種(Xcc)引起的對柑桔產(chǎn)業(yè)發(fā)展有巨大影響的世界性檢疫病害[23]，幾乎所有柑桔栽培品種感病，在尋找和培育抗病柑桔品種的同時，選育對柑桔潰瘍病具有一定抗性的優(yōu)良柑桔砧木則具有重大的意義。在本研究中，富民枳和小葉枳在酸處理下接種Xcc早期葉片菌含量相對較少，說明酸處理可能對Xcc侵染早期的增殖有抑制作用。不同枳種質(zhì)在早期所表現(xiàn)出的感病差異也可能與葉片PTI免疫途徑反應(yīng)(激活模式誘發(fā)的免疫反應(yīng))相關(guān)，這有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

實生幼苗生長早期洞口枳、富民枳、墨西哥飛龍枳、美國飛龍枳和變異枳能耐受短期酸堿脅迫，變異枳還能耐受較長期的酸脅迫。就實生幼苗葉片敏感性(葉片葉綠素含量與葉色變化)而言，富民枳對酸和堿脅迫的敏感性均較低，小葉枳幼苗葉片對酸脅迫敏感性較低，墨西哥飛龍枳幼苗葉片對堿脅迫敏感性較低，河南枳、美國飛龍枳葉片對酸脅迫的敏感性高于堿脅迫，洞口枳、小葉枳和變異枳對堿脅迫的敏感性高于酸脅迫。在抗氧化酶活性方面，洞口枳在酸和堿處理下似乎具有較強的活性氧清除能力。墨西哥飛龍枳在酸性環(huán)境下、河南枳和美國飛龍枳在堿性環(huán)境下對柑桔潰瘍病具有相對較強的抗性。