馬桑蠶（Coriaria sinicasilkworm）又名蓖麻蠶，以馬桑葉為食，故稱之為馬桑蠶[1]。馬桑（Coriaria sinicaMaxim.）是馬桑屬植物，全株有毒，果實(shí)毒性最大，因外形與桑葚相似，易被誤食而引發(fā)中毒[2]。馬桑毒性成分有羥基馬桑內(nèi)酯（Tutin）、馬桑寧內(nèi)酯（Corianin）、馬桑亭內(nèi)酯（Coriatin）等二環(huán)倍半萜內(nèi)酯毒素[3]。馬桑中毒能引起痙攣、嘔吐等一系列中毒癥狀，嚴(yán)重者可致死亡[4]。

目前，有關(guān)馬桑毒素的研究主要集中在藥理方面，如殺蟲抑菌等方面[7-8]。含量測(cè)定相關(guān)報(bào)道較少，相關(guān)研究主要是對(duì)人體血液、尿液及蜂蜜中馬桑內(nèi)酯進(jìn)行含量測(cè)定[9-11]。針對(duì)馬桑蠶蛹中馬桑內(nèi)酯的檢測(cè)方法尚未見報(bào)道。

本研究以馬桑蠶蛹為研究對(duì)象，建立了馬桑蠶蛹中3種馬桑內(nèi)酯的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的分析方法。該方法簡(jiǎn)單快速，準(zhǔn)確度和精密度高，可以為馬桑蠶蛹進(jìn)行深加工的質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬桑寧內(nèi)酯、馬桑亭內(nèi)酯、羥基馬桑內(nèi)酯（純度＞98 %）：云南西力生物技術(shù)股份有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）：上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Oasis PRiME HLB（3cc/150 mg）柱：美國(guó)waters公司；實(shí)驗(yàn)室所用水均為超純水。

超高效液相色譜儀（Agilent 1290）、三重四極桿質(zhì)譜儀（Agilent G6470，配有電噴霧離子源）：美國(guó)Agilent公司；刀式研磨粉碎儀（GM200）：德國(guó)Retsch公司；超純水機(jī)（Milli-Q）：美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

稱取試樣5.00 g，加入20 mL乙腈，超聲提取10 min，4 500 r·min-1離心5 min，取上清液過PRiME HLB柱，棄去前幾滴流出液，收集后續(xù)流出液，準(zhǔn)確移取2 mL濾液于40 ℃氮吹至近干，用1.0 mL10%乙腈溶液溶解，過膜，供儀器測(cè)定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取5 mg（精確至0.1 mg）3種馬桑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至刻度，濃度為1 mg·mL-1的單標(biāo)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：用基質(zhì)溶液配制濃度為10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1、200.0 μg·L-1以及500.0 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

由表2可以看出，使用FLAC3D模擬出的結(jié)果誤差最大，單一Elman網(wǎng)絡(luò)精度較高，但結(jié)合小波-模糊控制Elman網(wǎng)絡(luò)的方法精度較單一Elman和FLAC3D，有了顯著的提高，由圖11可看出，小波-模糊控制Elman網(wǎng)絡(luò)與拱頂位移變化曲線具有較高的貼合度，并減少了突變點(diǎn)的產(chǎn)生，較前兩種方法，精度有了較大的提高。

1.2.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）：美國(guó)Agilent公司；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為10.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 洗脫梯度表

（2）質(zhì)譜條件。ESI源；負(fù)離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring MRM）；毛細(xì)管電壓為-3.5 kV；霧化器壓力為40 psi；干燥氣流速為10 L·min-1；鞘氣流速為10 L·min-1；鞘氣溫度為300 ℃；目標(biāo)物質(zhì)譜條件見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法優(yōu)化

2.1.1 提取

（1）提取溶劑。研究對(duì)提取溶劑的種類進(jìn)行了考察，選取不同提取溶劑（乙腈、0.1%甲酸-乙腈、乙酸乙酯、0.1%甲酸-乙酸乙酯、甲醇及0.1%甲酸甲醇）對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行提取，結(jié)果以回收率表示。結(jié)果表明，幾種提取溶劑的提取效率差別明顯，乙腈提取率為70%～79%，0.1%甲酸-乙腈提取率為65%～72%，乙酸乙酯提取率為42%～55%，0.1%甲酸-乙酸乙酯提取率為41%～50%，甲醇提取率為40%～48%，0.1%甲酸甲醇提取率為40%～45%。其中，乙腈提取率最高。進(jìn)一步比較了不同濃度乙腈的提取效果（見圖1），圖中不同字母表示平均回收率差異顯著（P＜0.05）。隨著乙腈濃度的增加，提取率明顯增大（P＜0.05）。故選用100%乙腈作為提取液。

圖1 乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)目標(biāo)物回收率的影響圖（n=3）

圖2 超聲提取時(shí)間的回收率圖

2.1.2 凈化

蠶蛹中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂等物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)過程中需對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行去除，最大程度降低雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)考察了C18、PSA、PRiME HLB及Oasis HLB不同凈化方法對(duì)目標(biāo)物的凈化效果。結(jié)果如圖3所示，使用C18吸附劑凈化時(shí)，羥基馬桑內(nèi)酯和馬桑寧內(nèi)酯損失較多，回收率均低于40%；使用Oasis HLB固相萃取柱凈化時(shí)，馬桑亭內(nèi)酯和損失較多，回收率較差；使用PSA吸附劑的回收率為65%～69%，PRiME HLB小柱回收率為76%～86%，優(yōu)于其他3種（P＜0.05）。故實(shí)驗(yàn)選取PRiME HLB小柱。

圖3 不同凈化方法的回收率圖

2.2 儀器條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，并采用梯度洗脫程序?qū)δ繕?biāo)物有較好的分離度?？疾炝瞬煌袡C(jī)相（甲醇、乙腈）和水相（純水和0.1%甲酸溶液）組合的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用甲醇作為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物的響應(yīng)較好，但馬桑寧內(nèi)酯和馬桑亭內(nèi)酯色譜峰重疊；使用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)馬桑寧內(nèi)酯和馬桑亭內(nèi)酯有較好的分離，且水相中加入0.1%甲酸使目標(biāo)物的響應(yīng)較好。因此，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，目標(biāo)物保留時(shí)間見表1，圖4為不同流動(dòng)相的總離子流圖。

圖4 不同流動(dòng)相的總離子流圖

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

參考已有研究[8-9]配制200 ng·mL-1的3種馬桑內(nèi)酯混標(biāo)溶液，在負(fù)離子模式下一級(jí)全掃描得到母離子，在最優(yōu)碎裂電壓下進(jìn)行碰撞解離，通過子離子掃描得到定量和定性離子碎片離子信息，優(yōu)化碰撞能量，并對(duì)其他質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，如毛細(xì)管電壓、干燥和鞘氣的溫度及流速等，優(yōu)化結(jié)果見表2。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式：ME=[（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率/無(wú)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率）-1]×100%。通常，|ME|≤20%時(shí)，基質(zhì)干擾程度較低；|ME|在20%～50%時(shí)，為中等程度的基質(zhì)干擾效應(yīng)；|ME|≥50%時(shí)，表示基質(zhì)干擾強(qiáng)烈[10]。結(jié)果見表3，3種馬桑內(nèi)酯的均存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，在檢測(cè)過程中采取基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)工作液的方法來(lái)降低基質(zhì)效應(yīng)干擾。

2.4 方法回歸方程

用基質(zhì)液配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，以各組分的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，目標(biāo)物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均＞0.992。通過信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限（LOD），結(jié)果見表3。

表3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)表

2.5 回收率和精密度

分別添加低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平做6個(gè)平行，結(jié)果見表4。3種馬桑內(nèi)酯的平均回收率在76.6 %～94.1 %，RSD在3.6%～12.6%。

表4 加標(biāo)回收率和精密度表（n=6）

2.6 樣品測(cè)定

使用本研究建立的方法對(duì)馬桑蠶蛹及其糞便進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果馬桑蠶蛹中均未檢出3種馬桑內(nèi)酯化合物。通過對(duì)馬桑蠶蛹的糞便進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)糞便中3種馬桑內(nèi)酯均有檢出。

3 結(jié)論

建立了馬桑蠶蛹中羥基馬桑內(nèi)酯、馬桑寧內(nèi)酯和馬桑亭內(nèi)酯的UHPLC-MS/MS快速分析方法。結(jié)果顯示3種馬桑內(nèi)酯相關(guān)系數(shù)均＞0.992，平均加標(biāo)回收率為76.6%～94.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～12.6%（n=6）。利用建立的方法對(duì)馬桑蠶蛹及其糞便進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，馬桑蠶蛹中均未檢出，在其糞便中3種馬桑內(nèi)酯均有檢出。說(shuō)明在馬桑蠶蛹在消化馬桑葉的過程中，并未吸收馬桑葉中的馬桑內(nèi)脂，而是將其通過糞便排出體外。因此，加強(qiáng)馬桑內(nèi)脂在蠶蛹體內(nèi)代謝途徑和機(jī)理的進(jìn)一步深入研究，為馬桑蠶蛹綜合利用及產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。