吳長(zhǎng)輝

（藥用菌栽培與深加工國(guó)家地方聯(lián)合工程研發(fā)中心·福建仙芝樓生物科技有限公司，福建 福州 350001）

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝Ganoderma sinenseZhao.Xu et Zhang的干燥子實(shí)體［1］。藥理學(xué)研究表明，靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、保肝、抗腫瘤、抗衰老、提高機(jī)體耐缺氧能力等活性［2］。靈芝傳統(tǒng)用法為切厚片［3］，以水煎煮后服用，由于其纖維性強(qiáng)，水溶性浸出物僅約4%，有效成分利用率低。為提高靈芝的利用率，可將其制成300目的超微粉［4］，但靈芝經(jīng)超微粉碎后，原有性狀被破壞，建立有效的鑒別方法尤其重要。中藥特征圖譜為多指標(biāo)質(zhì)量控制模式，可較全面地反映化學(xué)成分的種類和數(shù)量，從而較全面、綜合地體現(xiàn)中藥質(zhì)量［5］，其中以高效液相色譜（HPLC）法應(yīng)用較廣［6］。靈芝含豐富的三萜類成分，特征較明顯［7-8］。故本研究中建立了靈芝超微粉的HPLC特征指紋圖譜，以為其質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

R205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；UV2450型紫外-可見分光光度計(jì)、LC20A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；TDL-40B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；XS05型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）；SK1200型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

靈芝超微粉（福建仙芝樓生物科技有限公司，批號(hào)見表1）；靈芝酸A對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為F6MX-ZHS2，含量≥95.0%）；靈芝酸C2對(duì)照品（批號(hào)為160305，含量≥98.0%）、靈芝酸F對(duì)照品（批號(hào)為160308，含量≥98.0%），均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；乙腈、甲醇均為色譜純，乙酸乙酯、甲酸均為分析純，水為純化水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-乙腈（B）-0.04%甲酸水溶液（C），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2 溶液制備

取靈芝酸A，C2，F(xiàn)對(duì)照品各5 mg，精密稱定，分別加甲醇溶解并定容至10 mL；分別取1 mL，置10 mL容量瓶中，加用甲醇定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取樣品約1 g，精密稱定，加乙酸乙酯50 mL，超聲（功率50 W，頻率53 Hz）提取30 min，濾過、蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S11）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以靈芝酸A峰為參照峰，計(jì)算主成分峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果主成分峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.4%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)為S11）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以靈芝酸A峰為參照峰，計(jì)算主成分峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果主成分峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.1%，主成分峰相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S11）適量，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以靈芝酸A峰為參照峰，計(jì)算主成分峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果主成分峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.3%，主成分峰相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與相似度評(píng)價(jià)

指紋圖譜建立：取11批樣品各適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將11批樣品的HPLC數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版），得11批樣品的HPLC疊加指紋圖譜（圖1），設(shè)S1樣品圖譜為參照，其他樣品色譜峰與參照?qǐng)D譜進(jìn)行自動(dòng)匹配，即得樣品共有模式的對(duì)照指紋圖譜（圖2），結(jié)果共確定11個(gè)共有峰。通過與對(duì)照品圖譜（圖3）的比對(duì)，確認(rèn)2號(hào)峰為靈芝酸C2，6號(hào)峰為靈芝酸A，9號(hào)峰為靈芝酸F。共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積見表3、表4。

表3 11批樣品高效液相色譜圖共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.3 Relative retention time of HPLC common peaks of 11 batches of samples

表4 11批樣品高效液相色譜圖共有峰的相對(duì)峰面積Tab.4 Relative peak areas of HPLC common peaks of 11 batches of samples

圖1 11批樣品高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprinst of 11 batches of samples

圖2 樣品高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of samples

圖3 對(duì)照品高效液相色譜圖2.Ganoderic acid C2 6.Ganoderic acid A 9.Ganoderic acid FFig.3 HPLC chromatograms of reference substances

相似度評(píng)價(jià)：以共有模式為對(duì)照?qǐng)D譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版本）軟件計(jì)算11批樣品的相似度。結(jié)果相似度均大于0.94，詳見表5。

表5 11批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.5 Similarity evaluation results of 11 batches of samples

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中比較了甲醇、乙醇和乙酸乙酯做提取溶劑時(shí)對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果采用前兩種溶劑提取時(shí)，供試品溶液色譜圖中前15 min的雜峰較多，而用乙酸乙酯提取的效果較好。因柱溫對(duì)分離效果影響較大［9-11］，預(yù)試驗(yàn)中對(duì)35℃和40℃柱溫進(jìn)行了對(duì)比研究，采用35℃時(shí)，色譜圖中25～40 min之間的色譜峰分離較差，而40℃時(shí)，各個(gè)色譜峰分離效果相對(duì)較好。對(duì)供試品溶液進(jìn)行190～800 nm全波長(zhǎng)掃描［12-13］，多數(shù)成分在254 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，主要色譜峰分離較好，且基線平穩(wěn)。

靈芝三萜酸類物質(zhì)的檢測(cè)分析，流動(dòng)相主要為甲醇、乙腈、甲酸水溶液等［4，14-15］，預(yù)試驗(yàn)中考察了甲醇-0.04%甲酸水溶液、乙腈-0.04%甲酸水溶液、甲醇-乙腈-0.04%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，分別按不同的洗脫程序進(jìn)行洗脫。結(jié)果甲醇-乙腈-0.04%甲酸水溶液三元梯度洗脫的效果較好。

本研究中收集了11個(gè)批次的靈芝超微粉，采用HPLC法進(jìn)行了特征指紋圖譜研究。由色譜圖可見，各批次樣品的色譜圖整體具有一定的相似性，主成分峰特征基本一致，相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于2.0%。由相對(duì)峰面積計(jì)算結(jié)果可見，部分色譜峰的相對(duì)峰面積差異較大，表明所含成分含量差異較大。

綜上所述，本研究中所建HPLC指紋圖譜可為靈芝超微粉的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。