林新文，唐閃光，武欣倩，朱光冕，李 穎，海 樂

（1.湖南省藥品審核查驗(yàn)中心，湖南 長沙 410001；2.湖南一格制藥有限公司，湖南 湘潭 411100）

過氧化碳酰胺是尿素與過氧化氫以氫鍵結(jié)合形成的配合物，臨床常用作靜脈給氧藥物，可治療因缺氧所致各種急重癥［1］。由于過氧化氫屬極弱酸（Ka=2.4×10-12），在堿性條件下易分解［2］，故需添加適量的pH調(diào)節(jié)劑穩(wěn)定其性質(zhì)。枸櫞酸又名檸檬酸，屬大分子有機(jī)酸，為藥物制劑中常用的pH調(diào)節(jié)劑，具有良好的理化特性。其添加量在藥典中未明確限定，可按實(shí)際生產(chǎn)需要量添加，但為了更好地確保臨床用藥的安全有效，采用準(zhǔn)確的測定方法，對于了解不同藥品中枸櫞酸的含量及對枸櫞酸加入量的控制有重要意義。目前枸櫞酸常用測定方法有高效液相色譜（HPLC）法、紫外-可見分光光度法、離子色譜法、氣相色譜法等［3-5］。其中，紫外-可見分光光度法的靈敏度較低，離子色譜法和氣相色譜法成本較高且操作較煩瑣。為此，本研究中采用HPLC法測定過氧化碳酰胺中枸櫞酸的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；MA105DU型電子天平（德國Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）；Evolution 220型紫外-可見分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 試藥

過氧化碳酰胺（批號分別為20191019，20191006，20191016）；枸櫞酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100396-201503，含量100%，規(guī)格為每支200 mg）；乙腈為色譜純，磷酸二氫銨為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫銨（A）-乙腈（以三乙胺調(diào)pH至7.0，B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：0.7 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase

2.2 溶液制備

取枸櫞酸對照品25.28 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用流動相A溶解并定容，作為對照品貯備液；精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，用流動相A定容，混勻，即得對照品溶液。取過氧化碳酰胺樣品1.00 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用流動相A定容，混勻，即得供試品溶液。以流動相A作為空白對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液各20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液與對照品溶液色譜在相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，理論板數(shù)以枸櫞酸峰計(jì)為14 514（>2 000），枸櫞酸峰拖尾因子為1.0（≤1.5），各成分基線分離良好，且陰性對照無干擾，表明專屬性好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Citric acidA.Reference solution B.Test solution C.Blank reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取對照品貯備液0.2，1.0，2.0，4.0，8.0 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相A定容，制成質(zhì)量濃度為10.11，50.56，101.12，202.24，404.48 μg/mL的系列對照品溶液。精密量取20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以枸櫞酸質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2.19×106X+4.57×103（r=0.998 0，n=5）。結(jié)果表明，枸櫞酸質(zhì)量濃度在10.11～404.48 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限與檢測限考察：精密量取2.2項(xiàng)下對照品溶液0.1 mL，加流動相A稀釋至200 mL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比為10∶1、3∶1時(shí)的待測成分質(zhì)量濃度分別記作定量限及檢測限。結(jié)果枸櫞酸定量限及檢測限分別為0.05 μg/mL及0.01 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果枸櫞酸峰面積的RSD為0.78%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果枸櫞酸峰面積的RSD為1.10%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取樣品（批號20191006）適量，各6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果枸櫞酸峰面積的RSD為0.64%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品（批號20191006）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的枸櫞酸對照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 耐用性試驗(yàn)

稱取樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置流速為0.56，0.70，0.84 mL/min）進(jìn)樣測定，記錄峰面積；取樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置流動相pH為5.6，7.0，8.4）進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果見表3?？梢姡鲃酉嗷蚱淞魉侔l(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of the durability test

2.5 樣品含量測定

取3批樣品各適量，各批平行測定2次，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 枸櫞酸含量測定結(jié)果（n=2）Tab.4 Results of content determination of citric acid in samples（n=2）

3 討論

現(xiàn)有研究對枸櫞酸含量的檢測主要集中于食品、飲料和飼料［6-11］，對于藥品中枸櫞酸的含量檢測報(bào)道較少。預(yù)試驗(yàn)中，取0.04 mg/mL過氧化碳酰胺溶液和0.50 mg/mL枸櫞酸對照品溶液進(jìn)行紫外光譜（190～260 nm波長）掃描，定性檢測。結(jié)果過氧化碳酰胺和枸櫞酸在190～240 nm波長范圍中存在末端吸收，隨著波長的增加，吸收逐漸減少，結(jié)合已有文獻(xiàn)［12-14］，選擇210 nm作為檢測波長。參考相關(guān)文獻(xiàn)［15］，選擇以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫銨作為流動相，并對流速等相關(guān)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在優(yōu)化后的色譜條件下，主要成分枸櫞酸與相鄰成分的色譜峰分離度良好。

綜上所述，本研究中建立了一種符合藥典相關(guān)要求，適用于藥品生產(chǎn)企業(yè)相關(guān)檢測，能有效測定過氧化碳酰胺中枸櫞酸含量的方法，并對每個參數(shù)設(shè)立了可以接受的標(biāo)準(zhǔn)和驗(yàn)證步驟。過氧化碳酰胺中枸櫞酸的含量測定，可為藥品中pH調(diào)節(jié)劑添加量的有效性和安全性提供保障。