張秉華，梁亞偉，王小亮，席志芳，衷紅梅，趙蒲中

（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

硝酸咪康唑屬三唑類廣譜抗真菌藥，臨床主要用于局部治療念珠菌性外陰陰道病和革蘭陽性菌引起的雙重感染［1-2］，其作用機制為影響細胞色素P450酶的活性，從而抑制真菌細胞膜合成，使細胞內重要物質外漏。硝酸咪康唑陰道軟膠囊的膠囊殼含有二氧化鈦、甘油、明膠等成分，可干擾過氧化酶和氧化酶的活性，引起細胞內的過氧化氫積聚，從而導致細胞亞結構變性和細胞壞死，有效緩解疾病癥狀［3-5］。目前，國內市售的該軟膠囊囊殼處方中均添加有適量抑菌劑羥苯乙酯和羥苯丙酯，兩者屬對羥基苯甲酸酯類，具有廣泛的抗菌活性［6-8］。但這類化合物具有低毒性，用量過多可危害人體健康，引起過敏性皮炎、DNA損傷、染色體畸變、生殖系統(tǒng)和內分泌毒性，同時還可增加乳腺癌風險［9-12］；用量不足則無法有效抑制微生物污染，可導致藥品的酸敗和霉變，影響藥品質量和用藥安全。硝酸咪康唑陰道軟膠囊囊殼中抑菌劑加入量應按2020年版《中國藥典（二部）》抑菌效力檢查法確定處方最低有效量，并通過理化測定法監(jiān)測羥苯乙酯和羥苯丙酯的加入量，確保制劑貨架期的抑菌效力和藥品質量安全［13-15］。為提高該制劑的質量控制標準，本研究中建立了同時測定硝酸咪康唑陰道軟膠囊囊殼中羥苯乙酯、羥苯丙酯含量的高效液相色譜（HPLC）法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XPE205型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q IQ 7000型超純水系統(tǒng)（德國Merck Millipore公司）；HY-4型調速多用振蕩器（天津鑫博得儀器有限公司）；HH-2A型恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試藥

硝酸咪康唑陰道軟膠囊（西安楊森制藥有限公司，批號分別為068968，068772，068462，編號分別記為樣1，樣2，樣3，標示量羥苯乙酯均為1.83 mg/粒，羥苯丙酯均為0.94 mg/粒；羥苯乙酯對照品（批號為100847-201604，含量99.9%）、羥苯丙酯對照品（批號為100444-201804，含量99.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex SynergiTMPolar-RP柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相：甲醇-水（58∶42，V/V）；流速：1.25 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：40℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取羥苯乙酯對照品與羥苯丙酯對照品各適量，精密稱定，加稀釋液［水-甲醇（60∶40，V/V），下同］溶解并稀釋，制成每1 mL中含羥苯乙酯0.272 9 mg與羥苯丙酯0.141 5 mg的溶液，作為混合對照品貯備液；精密量取4 mL，置200 mL容量瓶中，加水10 mL，1 mol/L鹽酸溶液1 mL及乙醚3 mL，加稀釋液定容，靜置30 min，加稀釋液再次定容，搖勻，作為混合對照品溶液。取樣品3粒，置1 000 mL容量瓶中，加水50 mL，0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL，35℃水浴并時時振搖分散所有囊殼后，加入乙醚15 mL，振搖15 min，加入500 mL稀釋液，振搖30 min，加稀釋液定容，靜置30 min，加稀釋液再次定容，搖勻，棄去上層漂浮物，將上層溶液濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取混合輔料（液體石蠟、白凡士林）0.469 8 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性與專屬性試驗：分別取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液在與對照品溶液保留時間相同處有相應色譜峰，羥苯乙酯峰與羥苯丙酯峰的分離良好（分離度>1.5），拖尾因子均為1.0，陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Ethylparaben 2.PropylparabenA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取混合對照品貯備液2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置200 mL容量瓶中，按2.2項下方法制備系列混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄羥苯乙酯峰與羥苯丙酯峰面積。分別以峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程，羥苯乙酯為Y1=4.64×104X1-6.63×103（r=0.999 8，n=5），羥苯丙酯為Y2=4.37×104X2-5.29×103（r=0.999 7，n=5）。結果表明，羥苯乙酯與羥苯丙酯質量濃度分別在2.729 3～8.187 8 μg/mL和1.415 3～4.245 9 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限考察：取羥苯乙酯、羥苯丙酯質量濃度分別為2.729 3 μg/mL和1.415 3 μg/mL的混合對照品溶液適量，逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以信噪比（S/N）為3和10的待測成分質量濃度分別作為檢測限和定量限，結果羥苯乙酯與羥苯丙酯的檢測限分別為0.136 5 ng和0.141 5 ng，定量限分別為0.272 9 ng和0.707 7 ng。

精密度試驗：取混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果羥苯乙酯和羥苯丙酯峰面積的RSD分別為0.08%和0.25%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液（批號為068968）適量，分別于室溫下放置0，4，8，12 h，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果羥苯乙酯與羥苯丙酯含量的RSD分別為0.33%和0.23%（n=4），表明供試品溶液室溫下放置12 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為068968）適量，按供試品溶液制備方法平行制備6份溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果羥苯乙酯和羥苯丙酯的平均含量分別為94.00%和86.00%，RSD分別為0.75%和1.46%（n=6），表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗：取羥苯乙酯對照品0.110 47 g、羥苯丙酯對照品0.056 84 g，精密稱定，置同一100 mL容量瓶中，加稀釋液定容，搖勻，作為羥苯乙酯、羥苯丙酯回收率貯備液。取樣品9份，每份3粒，分別置2 000 mL容量瓶中，加入精密量取的羥苯乙酯、羥苯丙酯回收率貯備液1.0，5.0，8.0 mL，各3份，按2.2項下方法制備供試品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 耐用性試驗

取2.2項下混合對照品溶液和供試品溶液，更換不同型號高效液相色譜儀（UltiMate3000型、Shimadzu LC2030C 3D型）和不同品牌色譜柱［Aglient Proshell 120 EC-C18柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）、Diamonsil Plus C18柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）］，改變柱溫（±3℃），按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果分離情況均符合要求，表明方法耐用性良好。

2.5 樣品含量測定

取不同批號3批樣品依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定4次，以外標法計算樣品中2種抑菌劑的含量。結果見表2。

表2 樣品中羥苯乙酯與羥苯丙酯含量測定結果（%，n=4）Tab.2 Results of content determination of ethylparaben and propylparaben in samples（%，n=4）

3 討論

目前，國內藥品的質量標準對抑菌劑含量的測定存在缺失，對外用制劑的抑菌劑添加量不夠重視，患者外用硝酸咪康唑陰道軟膠囊后常出現不適感，而抑菌劑會對皮膚黏膜產生刺激，也可通過皮膚黏膜進入體循環(huán)，應關注其過量使用的危害。故該制劑中抑菌劑的用量應為最低有效量，即保證有效性的同時盡量少添加，以最大限度地降低對皮膚的刺激。硝酸咪康唑陰道軟膠囊抑菌劑的含量測定方法未見報道，現行質量標準也未對抑菌劑進行限度檢查，為了更好地控制產品質量安全，保證制劑貨架期抑菌效力，有必要對兩種抑菌劑進行常規(guī)監(jiān)測。

本研究中結合歷年藥品檢驗工作中抑菌劑檢查所用方法，建立了同時測定硝酸咪康唑陰道軟膠囊囊殼中羥苯乙酯和羥苯丙酯含量的HPLC法，旨在提高該制劑的質量標準，同時為監(jiān)管部門和生產企業(yè)提供技術支持。后續(xù)將進一步測定市售該藥其他廠家樣品中抑菌劑的含量，并開展抑菌效力測定，通過對比分析，確定其抑菌劑的最低有效量，確保外用制劑的用藥安全。