張清文，汪正宇

（1.皖北煤電集團總醫(yī)院藥劑科，安徽 宿州 234000；2.安徽省宿州市食品藥品檢驗檢測中心，安徽 宿州 234000）

小兒寶泰康顆粒多用于治療小兒風熱外感引起的發(fā)熱、流涕、咳嗽和脈浮等證［1］，對上呼吸道感染有較好療效［2］。該藥由連翹、南板藍根、滇紫草、地黃、玄參、滇柴胡等12味藥材組方，現(xiàn)收載的2020年版《中國藥典（一部）》中僅以紫外-可見分光光度法測定制劑中浙貝母總生物堿含量，對其他藥材有效成分均無定量檢測要求。本研究中以連翹中連翹苷和連翹酯苷A含量、滇柴胡中柴胡皂苷d含量、甘草中甘草酸和綠原酸含量為評價指標，采用熵權(quán)法確定各指標權(quán)重系數(shù)并進行綜合評分，設(shè)計L9（34）正交試驗，以料液比、甲醇體積分數(shù)及提取時間為考察指標，通過直觀分析和方法分析優(yōu)選最佳醇提工藝，為小兒寶泰康顆粒進一步開發(fā)利用提供技術(shù)支持?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；ME204E型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500DE型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

小兒寶泰康顆粒［健民集團葉開泰國藥（隨州）有限公司，批號分別為210109，210118，210237，210232］；綠原酸對照品（批號為110753-202119，含量96.3%），連翹酯苷A對照品（批號為111810-202108，含量96.2%），連翹苷對照品（批號為110821-201816，含量95.1%），柴胡皂苷d對照品（批號為110778-201912，含量96.3%），甘草酸銨對照品（批號為110731-202021，含量96.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min時5%A，10 min時25%A，25 min時30%A，40 min時55%A，60 min時55%A，70 min時5%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取各對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL分別含綠原酸0.450 mg、連翹酯苷A 0.550 mg、連翹苷1.600 mg、柴胡皂苷d 0.160 mg、甘草酸銨0.330 mg的混合對照品貯備液；精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

供試品溶液：取樣品內(nèi)容物適量，研細，取細粉約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，加50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按小兒寶泰康顆粒處方和制備工藝制備缺連翹、滇柴胡、甘草的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.1.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.1.2項下3種溶液各適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、柴胡皂苷d、甘草酸銨色譜峰與相鄰峰分離良好（分離度>1.5），理論板數(shù)以連翹苷峰計大于5 000。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Chlorogenic acid 2.Forsythoside A 3.Forsythin 4.Saikosaponin d 5.Ammonium glycyrrhizinateA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.1.2項下混合對照品貯備液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0 mL，置5 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。精密量取10 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表1。

檢測限與定量限考察：分別精密量取2.1.2項下混合對照品溶液適量，加50%甲醇倍比稀釋，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）3∶1及10∶1時的進樣量分別記作檢測限及定量限。結(jié)果見表1。

表1 回歸方程、線性范圍與檢測限、定量限Tab.1 Results of the linear relation test，LOD and LOQ

精密度試驗：取2.1.2項下混合對照品溶液適量，按2.1.1項下色譜條件，連續(xù)3 d、每天1次和1 d內(nèi)連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、柴胡皂苷d、甘草酸銨峰面積的RSD，日間精密度分別0.62%，0.81%，0.18%，0.50%，0.67%（n=3），日內(nèi)精密度分別0.21%，0.43%，0.15%，0.20%，0.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.1.2項下供試品溶液（批號為210109）適量，分別于常溫下放置0，3，6，9，12，18，24，36，48 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、柴胡皂苷d、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.36%，0.78%，0.64%，1.22%，0.53%（n=9），表明供試品溶液在室溫放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（批號為210109）適量，按2.1.2項下方法制備供試品溶液6份，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、柴胡皂苷d、甘草酸銨的平均含量分別為1.985，2.786，7.911，0.705，1.698 mg/g，RSD分別為0.52%，0.78%，0.33%，0.89%，0.42%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品（批號為210109）內(nèi)容物適量，研細，取細粉約0.3 g，精密稱定，共6份，分別精密加入混合對照品貯備液1 mL，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2 正交試驗

試驗設(shè)計與結(jié)果：以料液比（A）、甲醇體積分數(shù)（B）和提取時間（C）為考察因素，綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、柴胡皂苷d、甘草酸銨含量為評價指標，采用L9（34）正交試驗法考察，因素與水平見表3，正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表3 因素與水平Tab.3 Factors and their levels

表4 L9（34）正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.4 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表5 方差分析結(jié)果Tab.5 Results of the ANOVA

結(jié)果分析：熵權(quán)法確定各指標權(quán)重關(guān)系為，柴胡皂苷d>綠原酸>甘草酸銨>連翹酯苷A>連翹苷，各考察因素對綜合評分影響程度為A>B>C，且僅因素A，C對綜合評分結(jié)果有顯著影響（P<0.05）。正交試驗設(shè)計校正模型的P<0.05，說明試驗設(shè)計科學合理。綜上所述，確定最優(yōu)提取工藝條件為A2B2C3，即料液比為1∶50（g/mL），甲醇體積分數(shù)為50%，提取時間為90 min。

2.3 驗證試驗

取3批樣品適量，每批平行3份，按優(yōu)選的醇提工藝提取，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算各成分含量。結(jié)果顯示，3批樣品試驗結(jié)果的RSD均小于0.40%（n=3），表明該優(yōu)選醇提工藝較穩(wěn)定。詳見表6。

表6 驗證試驗結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.6 Results of the validation test（mg/g，n=3）

3 討論

小兒寶泰康顆粒組方中，連翹為君藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風熱等功效，主要成分為連翹苷和連翹酯苷A［3-5］；滇柴胡產(chǎn)自云南，具有解表散寒、疏肝和胃等功效，主要成分為柴胡皂苷類化合物［6-7］；甘草具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、神經(jīng)保護、肝臟保護等藥理作用，含有三萜類、黃酮類、多糖類、香豆素類等多種化合物［8-12］。關(guān)于小兒寶泰康顆粒有效成分研究文獻較少，沈立茹等［11］采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法同時測定制劑中貝母素甲與貝母素乙含量，宣蓓蓓等［12］研究了該制劑的指紋圖譜及7種成分含量。中藥治病機制較復雜，故對于中成藥質(zhì)量考察應結(jié)合中醫(yī)理論綜合進行評價［13-14］。

預試驗中先后考察了加熱回流和超聲提取兩種提取方式，發(fā)現(xiàn)在相同條件下兩者各成分含量差異不明顯，故選擇操作更簡便的超聲提?。惶崛∪軇┻x擇時，考察甲醇、乙醇及水3種溶劑，結(jié)果以水為溶出介質(zhì)時，連翹酯苷A、柴胡皂苷d未被檢測出，且甲醇的提取效果比乙醇好，故采用甲醇作溶劑。

目前確定指標屬性權(quán)重方法有主觀賦權(quán)法、客觀賦權(quán)法和主客觀賦權(quán)法（或組合賦權(quán)法）三大類，熵權(quán)法屬客觀賦權(quán)法，近年來多用于中藥多指標成分分析中［15-18］。其根據(jù)各指標的變異程度，利用信息熵計算出各指標的熵權(quán)，再通過熵權(quán)對各指標的權(quán)重進行修正，從而得到較客觀的指標權(quán)重。本研究中以料液比、甲醇體積分數(shù)和提取時間為考察因素，以熵權(quán)法確定各指標權(quán)重求算綜合評分，通過正交試驗法得出最優(yōu)醇提工藝條件，并通過驗證試驗驗證。該工藝條件穩(wěn)定性較好，簡單實用，可為小兒寶泰康顆粒進一步開發(fā)利用提供參考。