潘 虹，李 飛，柴 碩，劉婷婷，劉 暢，隋小宇

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

甘草次酸（GA）是中藥甘草主要活性成分甘草酸的水解產(chǎn)物［1］，屬五環(huán)三萜化合物，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，熱穩(wěn)定好，具有抗炎、抗感染、抗腫瘤、鎮(zhèn)咳祛痰、免疫抑制作用，臨床多用于慢性肝炎和肝癌的治療［2-6］。但GA的水溶性較差，口服生物利用度低，限制了其臨床應(yīng)用［7］。目前多通過制備微乳、納米粒、環(huán)糊精包合物、固體分散體、脂質(zhì)體等劑型加以改善［8］。固體分散（SD）技術(shù)可將藥物以分子、微晶、非晶態(tài)的形式均勻分散在固體載體中，是提高低溶性藥物的溶出度和口服生物利用度的有效方法［9-11］。固體分散體常用的制備方法有熔融法、溶劑法、溶劑-熔融法、噴霧（冷凍）干燥法和研磨法，其中前三者為目前應(yīng)用較多、且較易實現(xiàn)的方法。熔融法具有時間短、無溶劑、成本低的優(yōu)點，溶劑法具有操作簡便、藥物分散均勻、無需高溫的優(yōu)點，溶劑-熔融法的溫度和混合時間均小于熔融法，可使藥物免受熱降解。此外，與溶劑法相比，熔融狀態(tài)的載體更易分散和溶解［12-13］。近年來，超臨界流體技術(shù)、噴霧（冷凍）干燥技術(shù)、熱熔擠出技術(shù)等新型技術(shù)也在逐步發(fā)展［14-15］。聚乙二醇（PEG）是由環(huán)氧乙烷聚合得到的水溶性聚合物，易溶于水和多種有機溶劑，在熱、酸、堿條件下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，熔點低、固化速度快，具有良好的生物相容性，活性較低，且無毒無刺激性［16-18］，適宜作為上述3種方法制備固體分散體時的載體。本研究中以PEG4000為載體，GA為主藥，比較上述3種方法制備的固體分散體的溶出性質(zhì)和理化性質(zhì)，為GA口服制劑的開發(fā)提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：LC-1000型高效液相色譜儀（山東魯南瑞虹化工儀器有限公司）；RCZ-8AⅡ型自動溶出儀（天津大學(xué)精密儀器廠）；S-4300型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀（賽默飛世爾科技<中國>有限公司）；HSC-1型DSC差示掃描量熱儀（北京恒久實驗設(shè)備有限公司）；D8 Advance型聚焦X射線衍射儀（德國Bruker公司）。

試藥：GA原料藥（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號為471-53-4，含量≥98%）；GA對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110723-201514，含量≥99%）；PEG4000、無水乙醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品（GA固體分散體）制備

熔融法：將處方量的GA原料藥及PEG4000置蒸發(fā)皿中，于70～80℃水浴加熱至熔融，攪拌。待藥物顆粒消失后，倒于不銹鋼板上形成薄層，于-20℃迅速冷卻固化2 h，取出后在干燥器內(nèi)干燥數(shù)天，研磨粉碎，過80目篩，得樣品1，備用。

溶劑-熔融法：將處方量的PEG4000置蒸發(fā)皿中，于70～80℃水浴加熱至熔融。將GA原料藥溶解于少量無水乙醇中，與熔融的PEG4000混合均勻，待無水乙醇完全揮發(fā)后，倒于不銹鋼板上形成薄層，于-20℃迅速冷卻固化2 h，取出后在干燥器內(nèi)干燥數(shù)天，研磨粉碎，過80目篩，得樣品2，備用。

溶劑法：將處方量的GA原料藥及PEG4000置蒸發(fā)皿中，于80～90℃水浴加熱溶解于無水乙醇中，攪拌，待溶劑完全揮發(fā)后，置干燥器內(nèi)干燥，研磨粉碎，過80目篩，得樣品3，備用。

1.2.2 體外溶出度考察

參考2020年版《中國藥典（二部）》附錄槳法，以900 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.8）作為固體分散體（相當于10.0 mg藥物）的溶出介質(zhì)，按藥載比1∶2，1∶4，1∶6，1∶8取樣品粉末適量，精密稱定，于（37±0.5）℃下，100 r/min轉(zhuǎn)動5，15，30，45，60，75，90，120 min時分別吸取5 mL，經(jīng)0.45 μm醋酸纖維素膜濾過，取續(xù)濾液，同時補充等體積同溫介質(zhì)5 mL。采用高效液相色譜法測定釋藥量，并計算GA累積溶出度。色譜條件，色譜柱為Zorbax C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水-冰醋酸（88∶11∶1，V/V/V），續(xù)濾液超聲脫氣，流速為1.0 mL/min，檢測波長為250 nm，柱溫為室溫，進樣量為20 μL［19］。以峰面積（A）為縱坐標、質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程A=0.478C+0.080 7（R2=0.999 9），GA質(zhì)量濃度在2.54～101.60 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。方法學(xué)考察試驗結(jié)果的RSD均小于2.0%，表明精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性均良好。

1.2.3 結(jié)構(gòu)表征

差示掃描量熱（DSC）分析：采用DSC掃描量熱儀。參比物為空鋁坩堝，掃描范圍為25～350℃，升溫速率為10℃/min，保溫時間為10 min。藥載比為1∶8（m/m），下同。

X-射線衍射（XRD）分析：采用聚焦X射線衍射儀。分析條件為，Cu-Kα靶，最大電壓為40 kV，電流為40 mA，掃描范圍為5°～50°，掃描速率為5°/min。

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）：采用傅里葉紅外光譜儀。將樣品與溴化鉀在瑪瑙研缽中混合，壓片。掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

傅里葉變換拉曼光譜（FTIR-Raman）：采用裝有NXR FT-Raman模塊（1 064 nm）的傅里葉紅外光譜儀。掃描范圍為3500～500 cm-1，累計掃描64次，分辨率為4 cm-1，光源設(shè)置外部光，CaF2分束鏡。

掃描電子顯微鏡（SEM）分析：采用掃描電子顯微鏡。取少量樣品粉末，均勻黏附于導(dǎo)電膠，噴金處理后，置樣品臺上抽真空觀察。分析條件為，真空鍍金5 min，加速壓力20.0 kV。

2 結(jié)果

2.1 溶出曲線比較

不同制備方法對溶出度有明顯影響，從曲線斜率看，當藥載比相同時，溶出度的大小順序為溶劑法>溶劑-熔融法>熔融法。藥載比對溶出度也有明顯影響，隨著藥載比從1∶2（m/m）變至1∶8（m/m），樣品的溶出度均逐漸增大，并且明顯高于GA原料藥的溶出度。在120 min時，3種方法制備樣品的累積溶出度不同，藥載比為1∶8（m/m）時，通過溶劑法、溶劑-熔融法和熔融法制備的樣品累積溶出度分別為94.17%，88.17%，77.89%。綜上，溶劑法制備的樣品具有更優(yōu)的溶出度。詳見圖1。

圖1 溶出曲線A.Solvent method B.Solvent-melting method C.Melting methodFig.1 Profile of dissolution rate

2.2 DSC比較

熱分析技術(shù)可用于推測藥物結(jié)晶度或藥物-載體相互作用的變化，若藥物發(fā)生非定形或與載體相互作用，相應(yīng)的熔點峰就會消失或減弱［20-21］。DSC譜圖見圖2。可見，GA在301℃處有明顯的熔融吸熱峰，即GA原料藥的熔點為301℃；PEG4000在60℃和288℃處均有熔融吸熱峰，其中60℃處峰較尖銳，288℃處峰較寬；物理混合物（PM）在280℃處有尖銳的吸熱峰，為PEG4000和GA在此處吸熱效應(yīng)疊加的結(jié)果；樣品1，2，3均在250℃之后未出現(xiàn)尖銳的吸熱峰，而分別在291，290，286℃處開始出現(xiàn)非常平緩的吸熱峰。從DSC譜圖變化可推斷，固體分散體形成后，GA的晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒕?，且熔點發(fā)生偏移，且樣品3的熔點偏移更大，表明其結(jié)晶度降低得更明顯。

圖2 差示掃描量熱分析譜圖a.GA b.PEG4000 c.PM d.Sample 1 e.Sample 2 f.Sample 3Fig.2 DSC spectra

2.3 XRD比較

結(jié)晶性藥物在不同的衍射帶中均具有晶體的特征衍射峰，這些峰在形成固體分散體后消失或減弱，表明藥物以非晶態(tài)或微晶形態(tài)存在于固體分散體中［22］。XRD譜圖見圖3?？梢?，GA在5°～16°之間有6個明顯的特征衍射峰；PEG4000在19°和23°處有2個特征衍射峰；PM的XRD譜圖中可觀察到GA和PEG4000各自的特征衍射峰；樣品1，2，3的XRD譜圖中，均可見到較強的PEG4000兩處特征衍射峰，但GA的特征衍射峰（15°處左右）的平均峰高均降低，其中樣品2，3特征衍射峰平均峰高均低于樣品1；與樣品2相比，樣品3的特征衍射峰平均峰高較低。綜上，溶劑法制備樣品的結(jié)晶度明顯低于其他兩種方法，且3種樣品的溶出度與其結(jié)晶度呈負相關(guān)。

圖3 X-射線衍射分析譜圖a.GA b.PEG4000 c.PM d.Sample 1 e.Sample 2 f.Sample 3Fig.3 XRD patterns

2.4 FTIR比較

固體分散體可增加與藥物-載體相互作用相關(guān)的藥物溶解度，藥物與載體之間的氫鍵對于解釋藥物在固體分散體中的物理狀態(tài)和穩(wěn)定性非常重要［23］。本研究中將FTIR用于檢測固體分散體系潛在的分子間相互作用。FTIR圖譜見圖4。GA在3 444，1 713，1 663 cm-1處有3個特征吸收峰，分別為GA的3號位—OH、11號位—CO—以及30號位—COOH的伸縮振動峰；PEG4000在3 448 cm-1和2 887cm-1處有2個特征吸收峰，分別為—OH的伸縮振動峰和—CH2—的伸縮振動峰；樣品1，2，3的紅外光譜中，GA的3號位—OH的吸收峰（3 444 cm-1）分別出現(xiàn)在3 441，3 442，3 440 cm-1處，且其峰寬較GA的峰更寬?？赡苁荊A與PEG4000形成氫鍵而締合的—OH伸縮振動成一系列多重疊峰，或是與PEG4000的—OH伸縮振動相疊加所致；樣品1，2，3的FTIR光譜中，GA原料藥的—CO—在1 713 cm-1處的特征吸收峰也分別移至1 705，1 703，1 704 cm-1處。這種向較低波長的轉(zhuǎn)變可能是由于GA上C3的—OH或環(huán)上的—CO—與PEG的ROH之間形成了分子間氫鍵。

圖4 紅外光譜圖a.GA b.PEG4000 c.PM d.Sample 1 e.Sample 2 f.Sample 3Fig.4 Infrared spectras

2.5 FTIR-Raman比較

拉曼光譜可用于固體分散體中聚合物與藥物的相互作用分析［24］。拉曼光譜見圖5?？梢姡珿A在1 665 cm-1拉曼位移處有2個尖銳且可與PEG4000進行明顯區(qū)分的特征峰，并且GA及PEG4000在2 880 cm-1附近各有一個較大的散射峰。因此，選取這2處特征峰與3種樣品拉曼光譜圖比較，由于分子間相互作用行為不同，非晶態(tài)和晶體態(tài)的拉曼光譜也有所不同。與晶體相比，非晶體形式的拉曼光譜有更寬的峰，由此反映了非晶形的隨機狀態(tài)［25］。2 880 cm-1處半峰寬大小順序為樣品3>樣品2>樣品1>GA，與GA拉曼光譜圖相比，3種樣品拉曼光譜的半峰寬均有所變大，這可能是固體分散體中GA的晶化率降低所致，且半峰寬的大小順序與3種樣品的溶出度呈正相關(guān)。而3種樣品在1 665 cm-1處的2個尖銳峰的峰高均較PM低。

圖5 拉曼光譜圖a.GA b.PEG4000 c.PM d.Sample 1 e.Sample 2 f.Sample 3Fig.5 Raman micrographs

2.6 SEM比較

SEM圖見圖6。GA原料藥為條狀晶體；PEG4000為片狀不規(guī)則態(tài)；3種樣品的SEM圖無明顯差別，均為不規(guī)則的片狀體，與PEG4000的形態(tài)一致，且3種樣品的SEM圖中未發(fā)現(xiàn)GA的條狀晶體形態(tài)存在。

圖6 掃描電子顯微鏡圖a.GA（×20 000）b.PEG4000（×5 000）c.PM（×20 000）d.Sample 1（×10 000）e.Sample 2（×10 000）f.Sample 3（×20 000）Fig.6 SEM graphs

3 討論

GA難溶于水，口服吸收較差，而將其制備成固體分散體可以改善其溶出度。本研究中采用熔融法、溶劑-熔融法和溶劑法分別制備，結(jié)果顯示，3種樣品的溶出度均明顯高于GA原料藥，且在相同藥載比條件下，樣品3的溶出度優(yōu)于樣品1和樣品2。從XRD分析可知，樣品3的結(jié)晶度明顯低于樣品1和樣品2，其抑制GA結(jié)晶的能力更強，更易于形成過飽和溶液，從而提高溶出度。另一方面，GA溶出度也與藥物的分散程度和粒徑尺寸有關(guān)，根據(jù)Noyes-Whitney方程，隨著藥物粒子逐漸變小，其比表面積變大，從而使溶出度增加［26］，采用溶劑法制備，藥物和載體以分子態(tài)充分混合，并且以共沉淀析出，混合體系較其他2種樣品更均勻。所以，樣品3中GA的分散度較其他2種樣品更高，藥物粒子的比表面積更大，因此具有更好的溶出效果。

本研究存在一定局限性。首先，由于實驗室條件有限，僅對上述3種方法進行了比較，一些新穎的方法，如超臨界流體技術(shù)、熔融擠出法等并未納入比較；其次，僅選用了PEG作為載體，未考察其他適用的載體；再次，僅對GA的體外溶出度進行了比較，未考察體內(nèi)溶出度。

目前，固體分散體是解決水溶性不良藥物口服生物利用度低問題的有效方法，發(fā)展至今已有4代，前3代旨在改善藥物的溶出度，而第4代則屬于控釋膠囊分散體。盡管一些與不穩(wěn)定性和可伸縮性有關(guān)的問題仍存在，但隨著學(xué)術(shù)和工業(yè)研究的發(fā)展，具有巨大潛力的新穎和優(yōu)化的制造技術(shù)正在引入。對藥物和載體的物理化學(xué)性質(zhì)和相互作用的深入研究、不同制備方法對藥物溶出的影響以及表征技術(shù)的改進可能有助于全面闡明固體分散體的結(jié)構(gòu)和溶解機理?？蔀殡y溶性藥物提供更好的載體選擇和制備方法，從而克服藥物的生物利用度問題以及固體分散體的穩(wěn)定性問題。