張華南，朱 杰，于立芹△，寧二娟，全彥濤

（1.河南省科學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省納普生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450002）

便秘為常見的胃腸功能紊亂，以排便次數(shù)減少、排便困難等為主要特征［1］。目前我國成人慢性便秘患病率為10.9%［2］，巴西、法國等國超22%［3］。便秘與飲食習(xí)慣、精神心理壓力及腸道原發(fā)性疾病、神經(jīng)源性疾病、代謝性疾病等多種因素有關(guān)［4］。便秘尤其是慢性便秘，不僅會直接影響患者的生活質(zhì)量，還可引發(fā)急性心腦血管疾病及胃炎、胃食管反流、痔瘡等胃腸道并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的健康［5］。功能性低聚糖不被機(jī)體消化吸收，進(jìn)入大腸后可維持腸道正常環(huán)境、刺激特定腸道微生物生長、調(diào)節(jié)腸道功能［6］。且其具有抑制肥胖、防便秘、調(diào)節(jié)血清膽固醇水平、增強(qiáng)機(jī)體免疫等多種藥理活性，尤以潤腸通便功能為近年來研究熱點(diǎn)［7-10］。常見的功能性低聚糖包括低聚果糖（FOS）、低聚木糖（XOS）與水蘇糖等，在嬰幼兒食品、烘焙工業(yè)與飲料工業(yè)中有廣泛應(yīng)用［11］。功能性低聚糖在自然界中種類較多，功能活性也有所差異［12］。鹽酸洛哌丁胺為外周性阿片受體激動劑，可抑制腸道水分泌和結(jié)腸蠕動，延遲糞便疏散時間和腸腔運(yùn)動，進(jìn)而引發(fā)便秘，常用于探索新的便秘治療藥物［13］?；诖?，本研究中采用鹽酸洛哌丁胺復(fù)制急性便秘小鼠模型，并比較XOS、水蘇糖與FOS對模型小鼠排便、小腸運(yùn)動及血清胃腸神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響，為功能性低聚糖在通便類功能食品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：imark酶標(biāo)儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品<上海>有限公司）；STX2201型便攜式電子天平（精度為0.1 g，奧豪斯儀器<上海>有限公司）。

試藥：鹽酸洛哌丁胺膠囊（西安楊森制藥有限公司，批號為LDJ130E，規(guī)格為每粒2 mg）；XOS（河南益常青生物科技有限公司，批號為HG200930F1，含量95%）；水蘇糖（西安天美生物科技股份有限公司，批號為SST20200805，含量90%）；FOS（河南益常青生物科技有限公司，批號為20200916036，含量95%）；乳果糖（北京韓美藥品有限公司，批號為19100015，規(guī)格為每袋15 mL，每1 mL含乳果糖0.667 g）；小鼠內(nèi)皮素（ET）試劑盒、P物質(zhì)（SP）試劑盒、生長抑素（SS）試劑盒、胃動素（MTL）試劑盒、胃泌素（Gas）試劑盒、血管活性腸肽（VIP）試 劑 盒（批 號 分 別 為20112309，20112345，20112393，20112392，20112305，20112346），均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

動物：SPF級KM小鼠120只，雄性，4周齡，體質(zhì)量（20±2）g，均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水和攝食，12 h晝夜變換，控制相對濕度為50%～70%，環(huán)境溫度為（23±1）℃。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處理均符合科學(xué)技術(shù)部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的要求。

1.2 方法

分組與給藥：120只小鼠隨機(jī)分為空白對照組（A組，等體積生理鹽水），模型組（B組，等體積生理鹽水），乳果糖組（C組，5 mL/kg），XOS組（D組，500 mg/kg），水蘇糖組（E組，500 mg/kg）與FOS組（F組，2 000 mg/kg），各20只。各組小鼠分別灌胃相應(yīng)藥物和生理鹽水。除C組外，其他各組灌胃體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)10 d。

體質(zhì)量：記錄小鼠給藥前后體質(zhì)量，并進(jìn)行組間比較。

通便實(shí)驗(yàn)：各組取10只小鼠，于給藥第0，3，9天測定24 h排便量（8：00、13：00、18：00各測1次，記錄總質(zhì)量）。末次給藥并禁食不禁飲16 h后，灌胃鹽酸洛哌丁胺混懸液（10 mg/kg）以復(fù)制急性便秘小鼠模型。30 min后，A組與B組小鼠灌胃墨汁，其余各組小鼠均灌胃含藥墨汁0.4 mL。從灌胃墨汁開始，記錄各組小鼠排首粒黑便時間以及6 h內(nèi)排便粒數(shù)與黑便質(zhì)量。

小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)：各組取10只小鼠，參照通便實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下方法建模與灌胃墨汁，灌胃墨汁30 min后，摘眼球取血并處死小鼠，理出腸系膜，剪取幽門至回盲部腸管，將小腸輕拉成直線，測量腸管長度，即為小腸總長度；從幽門至墨汁前沿即為墨汁推進(jìn)長度，計(jì)算墨汁推進(jìn)率。墨汁推進(jìn)率（%）=墨汁推進(jìn)長度（cm）/小腸總長度（cm）×100%。

胃腸神經(jīng)遞質(zhì)含量：取小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下血液，室溫放置30 min，5 000 r/min離心，分離，得血清，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定小鼠血清中SP，MTL，Gas，ET，VIP，SS水平，按試劑盒說明書要求操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量

結(jié)果見圖1。各給藥組小鼠的初始體質(zhì)量與A組均無顯著差異，表明小鼠分組均衡性良好。末次給藥后，與A組比較，E組及F組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P=0.050，0.031），D組及C組小鼠體質(zhì)量無明顯變化。

2.2 正常小鼠排便量

結(jié)果見表1?？梢?，隨著飼養(yǎng)時間延長，小鼠24 h排便量逐漸增多。僅E組小鼠給藥第9天24 h排便量及其與給藥第0天的差值均顯著大于A組（P=0.034，0.048）。

表1 各組小鼠建模前排便量比較（±s，g，n=10）Tab.1 Comparison of defecation volume of mice in each group 24 h before modeling（±s，g，n=10）

表1 各組小鼠建模前排便量比較（±s，g，n=10）Tab.1 Comparison of defecation volume of mice in each group 24 h before modeling（±s，g，n=10）

?

2.3 急性便秘模型小鼠排黑便量及時間

結(jié)果見表2。E組小鼠首粒黑便排出時間較B組顯著縮短（P=0.043），6 h黑便粒數(shù)及其質(zhì)量分別較B組顯著增加（P=0.022，0.009）。F組小鼠6 h黑便質(zhì)量較B組顯著增加（P=0.037）。

表2 各組小鼠建模后排黑便的量與時間比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of defecation volume and excretion time of black stool after modeling in each group（±s，n=10）

表2 各組小鼠建模后排黑便的量與時間比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of defecation volume and excretion time of black stool after modeling in each group（±s，n=10）

注：與B組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2、表3同。Note：Compared with those in group B，#P<0.05，##P<0.01（for Fig.2 and Tab.2-3）.

?

2.4 小腸墨汁推進(jìn)率

結(jié)果見圖2。B組小鼠小腸墨汁推進(jìn)率較A組顯著降低（P=0.004）；E組與C組小鼠小腸墨汁推進(jìn)率較B組顯著升高（P=0.024，0.000）。

圖2 小腸墨汁推進(jìn)率（n=10）Fig.2 Ink-pushing rate in small intestine（n=10）

2.5 血清胃腸神經(jīng)遞質(zhì)

結(jié)果見表3。與A組比較，B組小鼠血清MTL（P=0.048），SS（P=0.008）及VIP（P=0.026）水平顯著降低。與B組比較，C組小鼠SP（P=0.004）及SS水平（P=0.007）顯著升高；E組小鼠ET水平（P=0.034）與VIP（P=0.006）水平顯著降低，SP（P=0.016）水平顯著升高；F組小鼠Gas（P=0.022）及VIP（P=0.002）水平顯著降低。

表3 各組小鼠血清胃腸神經(jīng)遞質(zhì)水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of serum gastrointestinal neurotransmitter levels of mice in each group（±s，n=20）

表3 各組小鼠血清胃腸神經(jīng)遞質(zhì)水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of serum gastrointestinal neurotransmitter levels of mice in each group（±s，n=20）

?

3 討論

目前治療便秘的傳統(tǒng)藥物包括滲透性瀉藥與刺激性瀉藥，但僅可短期緩解，無法改善患者長期生活質(zhì)量，且藥品不良反應(yīng)較多［14］。新型腸道促分泌劑、5-羥色胺4受體激動劑、膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑等藥物耐受性與有效性尚待更多臨床研究證實(shí)［15］。針對老年人與青少年等特殊群體以及長期便秘人群，亟需作用溫和且安全有效的便秘治療藥物。目前已有多種以功能性低聚糖為原料的改善胃腸道功能保健食品，但由于產(chǎn)品所用原料來源不統(tǒng)一，用量參差不齊，效果差異較大［16］。開展其通便功能對比研究及相關(guān)機(jī)制的研究，對于開發(fā)穩(wěn)定有效的防治便秘藥物或潤腸通便功能食品具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，不同低聚糖對急性便秘模型小鼠的腸道運(yùn)動影響差異較大，水蘇糖可明顯提高排便量，而XOS與FOS效果相對較弱。與李雅麗等［17］的研究結(jié)果一致，即功能性低聚糖對腸道益生菌的作用可能是其影響排便的因素之一。XOS、水蘇糖與FOS均為水溶性膳食纖維，攝入后可改變腸道內(nèi)容物的滲透壓，同時增加糞便水分，刺激腸道蠕動，因此常用于減肥等功能食品中，但本研究中發(fā)現(xiàn)其可增加小鼠體質(zhì)量。有研究報(bào)道，實(shí)驗(yàn)動物可從FOS飼料中獲得比基礎(chǔ)飼料更多的能量，攝入FOS時動物體質(zhì)量會不斷升高［18-19］，與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，鹽酸洛哌丁胺干預(yù)后可顯著抑制小鼠小腸蠕動，減少排便粒數(shù)及黑便質(zhì)量，降低血清中興奮性遞質(zhì)MTL及SP水平，引發(fā)小鼠急性便秘癥狀。近年來研究發(fā)現(xiàn)，便秘尤其是慢性功能性便秘與胃腸激素分泌異常密切相關(guān)。SP，MTL，Gas，ET，SS，VIP均為重要的胃腸神經(jīng)遞質(zhì)。SP，MTL，Gas均屬興奮性遞質(zhì)，其中SP主要分布于腸道肌間神經(jīng)叢，能抑制胃腸道黏膜分泌，減慢胃腸道黏膜水、電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速度［20］，還可對胃腸縱行肌和環(huán)形肌產(chǎn)生雙重收縮效應(yīng)，從而刺激腸道運(yùn)動［21］；MTL可促進(jìn)胃蛋白酶的分泌，增加消化道的收縮與蠕動；Gas可促進(jìn)胃酸分泌、胃竇收縮及胃腸道黏膜生長，刺激消化道進(jìn)行機(jī)械運(yùn)動和電活動［22］。ET，SS，VIP屬抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其中ET是與心血管、腎臟與消化系統(tǒng)疾病等多種疾病相關(guān)的一種活性多肽，可由胃腸道黏膜細(xì)胞合成，與受體結(jié)合后可通過一系列反應(yīng)大幅升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而引發(fā)Ca2+介導(dǎo)的平滑肌收縮［23］；VIP是腸道肌間神經(jīng)叢中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與受體結(jié)合后可激活蛋白激酶A，抑制腸道環(huán)形肌收縮，使腸道較長時間處于舒張狀態(tài)，延長腸道傳輸時間［24-25］；SS能降低腸道消化液分泌，減少腸道蠕動，臨床常用于緩解腸梗阻類疾病，減少腸道過度運(yùn)動所引發(fā)的功能性損傷［26］。

本研究中所用3種功能性低聚糖結(jié)構(gòu)差異大，對急性便秘模型小鼠腸道運(yùn)動影響程度不同，且對多種胃腸神經(jīng)遞質(zhì)影響較復(fù)雜。水蘇糖主要源于草石蠶、澤蘭、地黃等植物，是由2分子α-半乳糖、1分子α-葡萄糖和1分子β-果糖構(gòu)成的四糖［27］；XOS是由2～7個木糖分子以β-1，4-糖苷鍵結(jié)合而成，通常以玉米芯、甘蔗、油茶殼、麥稈等農(nóng)業(yè)廢料為原料經(jīng)過化學(xué)法水解、發(fā)酵法和木聚糖酶酶解法制備而成［28］。FOS廣泛存在于馬鈴薯、洋蔥、香蕉等多種植物中，是由果糖和葡萄糖通過β-2，1-糖苷鍵連接而成［29］。本研究結(jié)果顯示，水蘇糖潤腸通便效果優(yōu)于XOS與FOS，可能因?yàn)樗K糖可顯著降低模型小鼠血清中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)水平及升高部分興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平，從而綜合發(fā)揮較強(qiáng)的促腸道運(yùn)動作用；而FOS與XOS作用機(jī)制較復(fù)雜，不能顯著影響模型小鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)水平。

綜上所述，功能性低聚糖中，水蘇糖對急性便秘模型小鼠的潤腸通便作用優(yōu)于XOS與FOS，但對其他便秘尤其是慢性便秘的影響及相關(guān)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。