賈世艷 仲啟明 司瑞花 范曉陽 嚴文允 劉光珍

膜性腎病是成人腎病綜合征的主要病因，約40%的患者在10年內(nèi)進展為終末期腎病，依賴腎透析治療[1-3]。目前膜性腎病治療以激素、免疫抑制劑和細胞毒類藥物為主，長期療效和安全性有待臨床的全面評估[4]。因此，尋找更安全有效的膜性腎病治療藥物成為亟待解決的問題。足細胞自我修復(fù)和再生能力有限，其損傷程度與膜性腎病預(yù)后密切相關(guān)，細胞凋亡是導(dǎo)致足細胞數(shù)量減少的重要機制和促進膜性腎病發(fā)展的重要因素，因此干預(yù)足細胞凋亡是延緩和治療膜性腎病有效策略[5-7]。復(fù)方蛇龍膠囊是課題組根據(jù)多年治療慢性腎臟病臨床經(jīng)驗，總結(jié)出“清熱利濕，活血化瘀”中醫(yī)組方理論基礎(chǔ)上形成的，前期研究表明復(fù)方蛇龍膠囊具有較高臨床緩解率，且無明顯毒副作用[8-9]。本研究擬從蛋白尿緩解、腎組織病理學(xué)改變和足細胞凋亡等方面，觀察復(fù)方蛇龍膠囊對陽離子化牛血清白蛋白誘導(dǎo)膜性腎病大鼠的治療作用，進一步探討其治療膜性腎病的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體質(zhì)量160～180 g，6周齡，共60只，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號SCXK(京)2017-0005，實驗方案符合山西省中醫(yī)藥研究院動物倫理要求，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度23～26 ℃，濕度45～50%，自由飲食飲水。

1.2 實驗藥物

復(fù)方蛇龍膠囊由穿山龍(批號：20191101)、鬼箭羽(批號：20190901)和白花蛇舌草(批號：20190801)組成，三種飲片均購自山西省中醫(yī)院藥房。將上述3味中藥加10倍水煎煮2次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.23～1.28(80 ℃)的清膏，真空干燥，粉碎成粗粉，備用；雷公藤多苷片(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 mg。批號：20170602)。

1.3 主要試劑與儀器

陽離子化牛血清白蛋白，弗氏不完全佐劑(美國Sigma公司，批號分別為102062773、344291)；肌酐(serum Creatinine，SCr)，甘油三脂(triglycerides，TG)，總膽固醇(total cholesterol，TC)，白蛋白(albumin，ALB)，總蛋白(total protein，TP)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20210225、20210304、20210226、20210226、20210301)；微量白蛋白(microalbumin，mALB)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(江蘇蘇州酶免生物技術(shù)有限公司，批號202012)；QuantiNova SYBR Green PCR Kit(德國QIAGEN公司，批號208054)；Alexa Fluor 488 Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(美國Invitrogen公司，貨號2268313)；兔來源一抗Nephrin，Podocin，Bcl-2，Bad，磷酸化蛋白激酶B(p-protein kinase B,p-Akt)，β-Actin(Abcam公司，批號分別為ab216341、ab181143、ab196495、ab32445、ab38449、ab179467)；二抗(Abcam公司，批號ab97051)。

H1型多功能微孔板讀板機(美國博騰)；7500型實時熒光定量儀(美國ABI公司)；Veriti9902型定性PCR儀(美國ABI公司)；Beckman Coulter流式細胞儀(美國Beckman公司)；Mini-Protean型電泳系統(tǒng)，Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國伯樂公司)；Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)(美國Kodak公司)；正置白光拍照顯微鏡(日本Nikon公司)；超薄切片機(Leica公司)；透射電子顯微鏡(Hitachi公司)。

1.4 動物模型制備、實驗分組及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，60只SD大鼠隨機分為正常組10只，造模組50只。按照改良 Border 法制備膜性腎病大鼠模型[10]，以大鼠24小時尿蛋白≥20 mg作為模型制備成功的標準。造模成功后，隨機分為模型組、雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組，每組10只。大鼠給藥劑量根據(jù)人與大鼠的體表面積換算成等效給藥劑量[11]，分別給予雷公藤多苷片7.5 mg/kg，復(fù)方蛇龍膠囊0.375 g/kg、0.75 g/kg、1.5 g/kg灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)8周。使用代謝籠留取大鼠24小時尿液，離心取上清，4℃保存?zhèn)溆?；實驗結(jié)束后，大鼠禁食水12小時后使用異氟烷吸入麻醉，留取血清及腎組織，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標檢測

1.5.1 血液和尿液生化指標檢測 按照試劑盒說明使用全自動生化分析儀檢測大鼠血清SCr、TG、TC、ALB、TP含量，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測尿mALB含量。

1.5.2 蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)、馬松(Masson)染色和透射電鏡檢測腎臟組織病理學(xué)變化 將固定于4%多聚甲醛的腎組織脫水，石蠟包埋，切片，分別按照HE和Masson染色方法進行制片，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)變化；2.5%戊二醛溶液固定腎組織，放置于PBS中浸洗3次，1%鋨酸固定，丙酮逐級脫水后進行包埋聚合、超薄切片，乙酸雙氧鈾和酸鉛雙重染色，進行透射電鏡觀察并拍照。

1.5.3 流式細胞術(shù)檢測腎臟組織細胞凋亡率 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組腎臟組織細胞凋亡變化，按照凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀上機檢測。

1.5.4 實時熒光定量PCR檢測腎組織Nephrin、Podocin、Bcl-2、Bad mRNA表達 采用Trizol法提取腎組織總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書配制擴增體系，擴增條件為95 ℃ 5分鐘，95 ℃ 5秒，60 ℃ 35秒，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-△△Ct法計算各基因mRNA相對表達水平。引物委托上海生物工程技術(shù)有限公司合成，見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.5.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測腎組織蛋白表達 使用RIPA緩沖液提取腎組織總蛋白，與5×Loading buffer混勻后100 ℃變性5分鐘，10% SDS-PAGE凝膠電泳45分鐘，PVDF轉(zhuǎn)膜90分鐘，5% BSA封閉PVDF膜60分鐘，一抗(Nephrin、Podocin、Bcl-2、Bad、β-Actin，1∶2 000)室溫孵育120分鐘，洗膜后二抗(1∶5 000)室溫孵育30分鐘，ECL法顯色，用Image J 軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白條帶/β-Actin 條帶灰度值作為蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠mALB、ALB、TP、TC、TG、SCr含量的影響

與正常組比較，模型組ALB和TP明顯降低，血清TC、TG、SCr和尿mALB明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組血清ALB和TP明顯升高，血清TC、TG、SCr和尿mALB明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 復(fù)方蛇龍膠囊對大鼠血液和尿液生化指標的影響

2.2 復(fù)方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織病理學(xué)改變的影響

正常組腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小管上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見腎組織纖維化，腎小球基底膜結(jié)構(gòu)完整，細胞器結(jié)構(gòu)形態(tài)正常；模型組腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細胞浸潤，藍色膠原纖維組織出現(xiàn)，基底膜增厚，足細胞損傷；與模型組相比，雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組腎小球和足細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不同程度改善，腎組織纖維化面積減少，腎小球基底膜病變減輕。見圖1～3。

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復(fù)方蛇龍膠囊低劑量組；E 復(fù)方蛇龍膠囊中劑量組；F 復(fù)方蛇龍膠囊高劑量組。

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復(fù)方蛇龍膠囊低劑量組；E 復(fù)方蛇龍膠囊中劑量組；F 復(fù)方蛇龍膠囊高劑量組。

2.3 復(fù)方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織細胞凋亡的影響

與正常組比較，模型組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖4。

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復(fù)方蛇龍膠囊低劑量組；E 復(fù)方蛇龍膠囊中劑量組；F 復(fù)方蛇龍膠囊高劑量組。與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.4 復(fù)方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織Nephrin、Podocin表達的影響

與正常組比較，模型組Nephrin和Podocin mRNA和蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組Nephrin和Podocin mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見表3，4，圖5。

表3 復(fù)方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織Nephrin、Podocin mRNA表達的影響

表4 復(fù)方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織Nephrin、Podocin蛋白表達的影響

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復(fù)方蛇龍膠囊低劑量組；E 復(fù)方蛇龍膠囊中劑量組；F 復(fù)方蛇龍膠囊高劑量組。

2.5 復(fù)方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織p-Akt、Bcl-2、Bad表達的影響

與正常組比較，模型組p-Akt蛋白表達明顯降低，Bcl-2 mRNA和蛋白表達明顯降低，Bad mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組p-Akt蛋白表達明顯升高，Bcl-2 mRNA和蛋白表達明顯升高，Bad mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表5、6，圖6。

表5 復(fù)方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎Bcl-2、Bad mRNA表達影響

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復(fù)方蛇龍膠囊低劑量組；E 復(fù)方蛇龍膠囊中劑量組；F 復(fù)方蛇龍膠囊高劑量組。

表6 復(fù)方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎p-Akt、Bcl-2、Bad蛋白表達影響

3 討論

膜性腎病臨床進展緩慢，病程較長，因此，對于經(jīng)保守治療未達到自發(fā)緩解的顯著蛋白尿患者，KDIGO指南推薦包括皮質(zhì)類固醇和環(huán)磷酰胺交替療程的改良Ponticelli方案作為一線治療[12-13]。近年來，我國傳統(tǒng)醫(yī)藥在膜性腎病治療的臨床實踐中積累了大量臨床研究成果，在世界范圍內(nèi)逐漸得到認可和廣泛應(yīng)用[14-15]。

膜性腎病的主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿和低蛋白血癥，是膜性腎病診斷和療效評價的關(guān)鍵指標[16]。腎小球濾過屏障功能和形態(tài)異常，導(dǎo)致尿蛋白含量升高，血清ALB和TP含量下降，進而促使肝臟代償性合成白蛋白和脂蛋白等，誘發(fā)高脂血癥，加重腎小球硬化、腎管間質(zhì)損傷等，相互作用促進病程進展，致使腎小球硬化，最終進展為終末期腎病[17-18]。本研究采用改良Border法制備膜性大鼠模型，研究結(jié)果顯示復(fù)方蛇龍膠囊干預(yù)8周后，大鼠尿mALB含量明顯降低，血清ALB明顯升高，血尿生化指標趨于正常，腎臟病理損傷程度得到改善，進一步說明復(fù)方蛇龍膠囊能通過改善腎小球濾過屏障功能、減輕足細胞損傷、減少腎組織纖維化程度，從而延緩膜性腎病進展。

腎小球濾過屏障由腎小球內(nèi)皮細胞、腎小球基底膜和足細胞組成。足細胞是一種高度分化的上皮細胞，通過調(diào)節(jié)穿過分隔血液和尿間隙的毛細血管壁的選擇性過濾而構(gòu)成腎濾過屏障的核心細胞基礎(chǔ)[19]。作為膜性腎病發(fā)病的關(guān)鍵機制，足細胞損傷主要與足細胞特異性蛋白及細胞骨架蛋白表達異常相關(guān)，Podocin是足細胞中唯一整合膜蛋白，能夠直接與Nephrin相互作用，在形成足細胞裂孔膜支架和控制腎小球濾過膜通透性中具有重要作用，Podocin表達水平降低將導(dǎo)致足細胞凋亡和裂孔膜結(jié)構(gòu)被破壞[20-21]。Nephrin作為裂孔膜的關(guān)鍵成分，能夠向細胞內(nèi)傳遞信號，Nephrin表達缺失或細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)異常將導(dǎo)致足細胞形態(tài)改變和蛋白尿產(chǎn)生[22-23]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方蛇龍膠囊干預(yù)后能夠抑制膜性腎病大鼠腎組織細胞凋亡，促進足細胞標志分子Nephrin和Podocin表達水平升高，進而恢復(fù)足細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，修復(fù)腎小球濾過屏障功能，有效降低尿蛋白。

膜性腎病病程遷延，涉及多個基因和信號通路的改變，其復(fù)雜發(fā)病機制尚不完全清楚。研究表明激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路能夠抑制細胞凋亡，保護足細胞并改善蛋白尿[24-25]。p-Akt是PI3K的主要下游效應(yīng)分子，能夠阻斷Bcl-2和Bad的結(jié)合，從而抑制細胞凋亡[26-27]。Bcl-2和Bad均為Bcl-2 家族成員，在維持線粒體膜完整性和細胞凋亡過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[28-30]。本研究顯示，膜性腎病大鼠腎組織細胞凋亡率明顯升高，Bad表達水平明顯升高，Bcl-2和p-Akt表達水平明顯降低，而經(jīng)過復(fù)方蛇龍膠囊干預(yù)后，凋亡信號通路被抑制，Bad表達水平明顯降低，Bcl-2和p-Akt表達水平明顯升高，復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組腎組織細胞凋亡率較模型組明顯降低，結(jié)果表明復(fù)方蛇龍膠囊對陽離子化牛血清白蛋白誘導(dǎo)的膜性腎病大鼠腎組織細胞凋亡具有較強的抑制作用。

綜上所述，復(fù)方蛇龍膠囊能夠抑制足細胞損傷和凋亡，維持細胞形態(tài)功能和數(shù)量穩(wěn)定，進而恢復(fù)腎小球濾過屏障的完整性，減少尿蛋白含量，這一過程可能是通過PI3K/Akt信號通過實現(xiàn)，其詳細作用機制仍值得進一步探究。