張一凡 劉萍

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[1]。近些年研究人員逐漸聚焦到胞葬作用及其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用[2]，胞葬作用通過吞噬細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞)及時(shí)清理凋亡細(xì)胞，促進(jìn)炎癥消退及膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，縮小壞死核面積，增加斑塊穩(wěn)定性[3]。小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞通常被用來體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，但對其胞葬作用的研究較少。

本課題組結(jié)合中醫(yī)理論和前期的臨床研究，以瓜蔞薤白半夏湯為基礎(chǔ)方，化裁得到冠心康。冠心康由黃芪、丹參、瓜蔞、薤白、半夏、益母草組成，具有益氣化痰活血之效。前期研究發(fā)現(xiàn)，冠心康可以促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾臟巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞的胞葬作用改善動(dòng)脈粥樣硬化[4-6]。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察冠心康凍干粉(以下簡稱“冠心康”)對小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞小分子類泛素修飾物特異性蛋白酶1(small ubiquitin-related modifiers /sentri-specific proteases 1，SENP1)/信號傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)分子表達(dá)及胞葬作用的影響，進(jìn)一步探討冠心康治療動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6J小鼠6只，6周齡，體質(zhì)量為18～23 g，購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2018-0008，動(dòng)物合格證號：202000150。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號:2019-N002)。

1.2 試劑與儀器

RIPA裂解液(批號：P0013B)、BCA蛋白定量試劑盒(批號：P0010)、SDS-PAGE電泳試劑(批號：103019200702)、中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(批號：030521210525)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(批號：100421211007)，均購自碧云天生物技術(shù)有限公司； STAT3、P-STAT3、GAPDH抗體(貨號：34、12、7)，購自美國CST公司；TAM酪氨酸激酶受體(TYRO3/AXL/MER receptor tyrosine kinase)、血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin 1，THBS1)、乳脂球表皮生長因子8(milk fat globule-epidermal growth factor，MFGE8)抗體(批號：GR284192-5、GR220083-6、GR153845-2、GR3304513-1)，均購自英國Abcam公司；SENP1抗體(批號：K0817)，購自美國Santa cruz公司；引物(批號：111359735)由上海閃晶分子生物科技有限公司合成；氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL，批號：H3011720)，購自上海翊圣生物科技有限公司。

高速冷凍離心機(jī)(型號5810R，德國 Eppendorf 公司)；StepOne Plus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號7500，美國 ABI 公司)；酶標(biāo)儀(型號SynergyH4，美國BioTek公司)；凝膠成像儀(型號731BR02744)、蛋白電泳儀(型號552BR 225015)，均購自美國BIO-RAD公司；顯微鏡(型號403497，日本尼康公司)。

1.3 藥物及凍干粉制備

冠心康(黃芪30 g、全瓜蔞15 g、薤白12 g、制半夏12 g、益母草30 g、丹參12 g)，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房提供。將全部草藥放入煎藥容器煎煮2次；藥液放冷后無菌紗布過濾3次，利用旋蒸儀，將中藥水煎液濃縮至 1 g/mL，置于-80℃冰箱過夜；次日使用冷凍干燥機(jī)制備冠心康凍干粉。DMEM培養(yǎng)基溶解凍干粉，超聲混勻過夜，混勻溶液用0.22 μm濾器過濾除菌，配制成50 μg /mL原液，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋至所需濃度。

1.4 骨髓源巨噬細(xì)胞的提取、培養(yǎng)、分組[7]

選取SPF級小鼠，腹腔麻醉后采用脊椎脫臼法處死小鼠，在75%乙醇中浸泡5分鐘，用剪刀分離雙腿，剔除腿部肌肉組織及其他軟組織，暴露出完整的股骨及脛骨；浸入75%乙醇中 5分鐘，預(yù)冷無菌 PBS 5分鐘；在關(guān)節(jié)處剪斷腿骨；用無血清的 DMEM 培養(yǎng)基沖洗腿骨，將骨髓沖洗液加入到離心管中，1 000 r/min離心 5分鐘；去上清，加入10 mL 含巨噬細(xì)胞集落刺激因子(10 μg/L)和含10%血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸，然后分裝到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于 37 ℃, 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

選取上述細(xì)胞，用ox-LDL 40 μg/mL誘導(dǎo)6小時(shí)，并分別給予含有冠心康凍干粉低、中、高劑量(1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL)的培養(yǎng)基，分為對照組、模型組、冠心康低劑量組、冠心康中劑量組、冠心康高劑量組。提取細(xì)胞樣本做后續(xù)檢測，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 免疫熒光檢測巨噬細(xì)胞純度

在 24 孔板中，加入濃度為 1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)。24小時(shí)后，棄上清，4%多聚甲醛固定10分鐘，0.1% Triton-X-100通透細(xì)胞15分鐘。含5% BSA 的0.2% PBST封閉細(xì)胞1小時(shí)。以一抗F4/80(1∶100)4 ℃ 孵育過夜，二抗(1∶1 000)室溫避光孵育 1小時(shí)。DAPI染核1分鐘，避光。在倒置相差熒光顯微鏡觀察拍照。

1.6 中性紅法檢測細(xì)胞吞噬率

在96孔板中，加入濃度為3×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液100 μL，培養(yǎng)24小時(shí)；PBS洗3次，分別加入完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基+ox-LDL、完全培養(yǎng)基+ox-LDL+低、中、高劑量冠心康，培養(yǎng)24小時(shí)；PBS 洗3次，每孔加入20 μL中性紅染色液+200 μL培養(yǎng)基，孵育2小時(shí)；去除含有中性紅染色液的細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗3次，加入200μL中性紅檢測裂解液，室溫?fù)u床上裂解10分鐘。測定540 nm處OD值。

1.7 胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)測定AXL、MERTK、TYRO3、THBS1 mRNA表達(dá)，按照Trizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA選用ABI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。在StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。采用2-△△Ct法分析結(jié)果，計(jì)算目的基因在各組的相對表達(dá)量。引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 蛋白免疫印跡法 (Western blotting)檢測胞葬相關(guān)蛋白表達(dá)

加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白。采用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品上樣至聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)至 PVDF膜。封閉1小時(shí)后，分別以一抗(1∶1 000)4℃ 孵育過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1小時(shí)。電化學(xué)法顯影后，采集條帶并進(jìn)行灰度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞純度

免疫熒光檢測巨噬細(xì)胞的純度，巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物 F4/80表達(dá)陽性細(xì)胞比例達(dá)到 99%，表明小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功。見圖1。

2.2 冠心康對骨髓源巨噬細(xì)胞吞噬率的影響

運(yùn)用中性紅法檢測細(xì)胞吞噬率。與對照組比較，模型組細(xì)胞吞噬率降低(P<0.05)；給予不同劑量的冠心康干預(yù)后，細(xì)胞吞噬率升高(P<0.05)，表明冠心康增強(qiáng)了小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞的吞噬功能。見表2。

表2 冠心康對骨髓源巨噬細(xì)胞吞噬率的影響

2.3 冠心康對骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響

運(yùn)用qRT-PCR法檢測各組細(xì)胞胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)。與對照組比較，模型組細(xì)胞AXL、MERTK、TYRO3、THBS1的mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；給予不同劑量的冠心康干預(yù)后，冠心康高劑量組AXL的mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，冠心康中劑量組TYRO3的mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，冠心康中、高劑量組MERTK、THBS1的mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，表明冠心康促進(jìn)小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)。見表3。

表3 冠心康對骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響

2.4 冠心康對骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響

運(yùn)用Western Blotting法檢測各組細(xì)胞胞葬相關(guān)分子蛋白表達(dá)。與對照組比較，模型組細(xì)胞AXL、MERTK、TYRO3、THBS1、MFGE8 蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；給予冠心康干預(yù)后，冠心康低、中、高劑量組AXL、MERTK、TYRO3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，冠心康中、高劑量組THBS1、MFGE8y蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，表明冠心康促進(jìn)小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子蛋白表達(dá)。見圖2、表4。

注：A 對照組；B 模型組；C 冠心康低劑量組；D 冠心康中劑量組；E 冠心康高劑量組

表4 冠心康對骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響

2.5 冠心康對骨髓源巨噬細(xì)胞SENP1/p-STAT3分子蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組細(xì)胞SENP1、p-STAT3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；給予冠心康干預(yù)后，冠心康低、中、高劑量組SENP1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，冠心康中、高劑量組 p-STAT3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，表明冠心康促進(jìn)SENP1/p-STAT3分子表達(dá)。見圖3、表5。

注：A 對照組;B 模型組;C 冠心康低劑量組;D 冠心康中劑量組;E 冠心康高劑量組

表5 冠心康對骨髓源巨噬細(xì)胞SENP1/p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”“脈痹”等范疇。葉天士《臨證指南醫(yī)案》曰：“痹者……皆由氣血虧損，腠理疏豁，風(fēng)寒濕三氣得以乘虛外襲，留滯于內(nèi)以致濕痰、濁血流注凝澀而得之?！北咀C為本虛標(biāo)實(shí)之證，脾腎兩虛，氣虛導(dǎo)致痰濁、血瘀內(nèi)生，痰瘀互結(jié)，痹阻脈絡(luò)，發(fā)為痹癥[8]。因此在治療上需要健脾益氣、化痰祛瘀的治法[9]。本課題組結(jié)合動(dòng)脈粥樣硬化氣虛痰瘀的中醫(yī)病機(jī)和前期的臨床研究，以瓜蔞薤白半夏湯為基礎(chǔ)方臨證化裁為黃芪、丹參、瓜蔞、薤白、半夏、益母草，組成冠心康。全方以黃芪為君藥，補(bǔ)氣虛治本，其主要活性成分黃芪多糖能提高巨噬細(xì)胞吞噬活性[10]；瓜蔞、丹參為臣藥，化痰活血，其中丹參多種活性成分如丹酚酸B、丹參酮IIA，對胞葬作用均有調(diào)控作用[11]；薤白、半夏、益母草為佐藥，助臣藥化痰活血之力。全方具有益氣活血、化痰降濁之效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4-6]，冠心康有效改善小鼠動(dòng)脈粥樣硬化，上調(diào)THBS1和TAM受體蛋白，促進(jìn)胞葬作用，但冠心康調(diào)控胞葬作用的機(jī)制尚不完善。

有效的胞葬作用能防止凋亡細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性壞死以及釋放炎性因子，減緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[12]。胞葬作用的有效完成需要多種分子協(xié)同配合，如“尋我”信號分子、“食我”信號分子、橋接分子等。TAM酪氨酸激酶受體家族作為 “食我”受體，包括TYRO3、AXL和MERTK。當(dāng)MERTK缺失會加重小鼠炎癥，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[13]；TYRO3和MERTK的變異與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生關(guān)系密切[14]。THBS1、MFGE8均是橋接分子，負(fù)責(zé)結(jié)合凋亡細(xì)胞“食我”信號分子與巨噬細(xì)胞的吞噬受體。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓源性細(xì)胞中缺乏MFGE8會增加斑塊中凋亡細(xì)胞的積累[15]。在晚期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中，MFGE8、MERTK等多種胞葬相關(guān)分子發(fā)揮重要作用清除斑塊中凋亡細(xì)胞[16]。

SENP1是一種半胱氨酸特異的蛋白酶，是SENP家族酶活性較強(qiáng)且最為經(jīng)典的成員，可以調(diào)控血管生成、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等[17]。研究發(fā)現(xiàn)，SENP1+/-小鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積顯著增大[18]。STAT3是信號傳導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)等[19]。研究發(fā)現(xiàn)，SENP1可以上調(diào)STAT3的磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性，活化的STAT3可以提高巨噬細(xì)胞的胞葬作用[20-21]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細(xì)胞吞噬率、胞葬相關(guān)分子、SENP1、p-STAT3表達(dá)量降低；與模型組比較，冠心康干預(yù)后，細(xì)胞吞噬率、胞葬相關(guān)分子、SENP1、p-STAT3表達(dá)量升高。綜上所述，冠心康通過上調(diào)SENP1的表達(dá)，促進(jìn)STAT3的磷酸化，從而增強(qiáng)骨髓源巨噬細(xì)胞的胞葬作用，但相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究為SENP1、STAT3與巨噬細(xì)胞胞葬作用的關(guān)系提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。