趙帥 程艷婷 朱濤 丁彥澤 侯玉鐸 孟立強
化療是惡性腫瘤治療的三大手段之一,而經(jīng)化療藥物治療后出現(xiàn)的種種不良反應,嚴重影響了患者的生存質量[1]。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)作為烷化類免疫抑制劑,被廣泛用于腫瘤的化療中,其細胞毒性明顯,可破壞細胞內(nèi)部DNA結構,阻斷復制途徑,影響分裂,導致細胞死亡[2]。因其殺死細胞的作用不具有特異性,同樣也會對骨髓產(chǎn)生嚴重影響,損害造血干細胞,降低外周血白細胞[3]。
造血細胞的正常發(fā)育、成熟保障了造血功能的穩(wěn)定,而整個過程都與細胞凋亡的參與密不可分。細胞凋亡的信號傳導以及是否發(fā)生凋亡,有許多信號分子的參與,癌基因、原癌基因為人所熟知,其中Bcl-2家族占有關鍵性作用[4]。報道表明[5-7],麥粒灸具有調節(jié)機體免疫功能、增強抗病能力的作用。麥粒灸因其溫熱之性,作用于特定腧穴,達到扶正固本、達邪外出之功[8]。本實驗以CTX建立小鼠白細胞減少癥模型,從外周血白細胞計數(shù)、骨髓形態(tài)學、骨髓細胞凋亡情況和凋亡相關蛋白B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)/Bcl-2關聯(lián)X蛋白(Bcl-2 associated X,BAX)表達量四個方面,探討CTX小鼠經(jīng)麥粒灸治療后對其產(chǎn)生的影響,并進一步研究麥粒灸抑制細胞凋亡、減緩骨髓抑制的作用機理。
7周齡SPF級雄性CD1(ICR)小鼠45只,體質量(35±1)g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2016-0006。動物實驗按山西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會章程規(guī)范操作,倫理審批號:2019DW233。實驗小鼠按隨機數(shù)字法分為空白組、模型組、麥粒灸組,每組15只。
注射用環(huán)磷酰胺(安道生,Baxter Oncology GmbH,0.2 g/瓶,批號:0E386A),多聚甲醛固定液(Servicebio公司,貨號:G1101-500ML),Annexin V-FITC/PI Cell Apoptosis Detection Kit(Servicebio公司,貨號:G1511),20×檸檬酸抗原修復液(Servicebio公司,貨號:G1202-250ML),蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染液(Servicebio公司,貨號:G1005-500ML),牛血清白蛋白(Servicebio公司,貨號:G5001-5G),免疫組化二抗試劑盒(Servicebio公司,貨號:G1215-200T),Bcl2 Antibody(Cusabio,貨號:CSB-RA002611A0HU),BAX Antibody(Cusabio,貨號:CSB-PA000976)。
顯微鏡(日本Nikon公司,型號:ECLIPSE Ci_S),切片機(亞光醫(yī)用電子技術有限公司,型號:YGQ-III),BD流式細胞儀(美國BD公司,型號:FACSCalibur)。
除空白組外其余小鼠均做造模處理,造模方法為腹腔注射CTX 80 mg/kg,每日一次,連續(xù)3天,建立白細胞減少癥模型小鼠[9];空白組相同時間腹腔注射0.2 mL生理鹽水。
依課題組前期成果取穴大椎、足三里、三陰交[10-11]。定位參考《中國獸醫(yī)針灸學》[12],小鼠取穴模擬大鼠的定位方法:大椎位于頸7與胸1之間,后正中線上;足三里位于膝關節(jié)后外側,腓骨小頭下5 mm;三陰交位于內(nèi)踝尖直上10 mm。
麥粒灸組:選用上述腧穴,每天用麥粒大小艾柱(1 g)進行艾灸,以小鼠強力扭轉身體為度,每穴各三壯。每日1次,連續(xù)7天。
空白組、模型組:連續(xù)7天陪同麥粒灸組小鼠做抓取、固定動作,且時間、力度相同,不做麥粒灸治療。
末次治療結束后,頸椎脫臼法處死小鼠,摘取左側完整股骨,除凈軟組織,置于固定液中;右側股骨同樣去除軟組織,并剪去兩側干骺端,用2 mL注射器吸取定量PBS將紅色條帶狀骨髓沖出,再用1 mL注射器針頭反復吸取過濾制成單個骨髓細胞懸液備用。
1.6.1 外周血白細胞計數(shù) 小鼠于CTX造模前當天、治療第3天、5天、7天完成后,用手術刀片于尾靜脈處劃割采血,吸取血樣10 μL/只,滴入稀釋液中混勻,取少許懸液,鏡下計數(shù)。
1.6.2 骨髓形態(tài)學觀察 股骨經(jīng)多聚甲醛固定24小時后,置于EDTA脫鈣液中,以股骨富有彈性能被輕易折彎,或針尖能輕松刺入組織時判斷脫鈣完成,流水沖洗后即可進行脫水、浸蠟、包埋、切片、染色,200倍光學顯微鏡下觀察拍照。
1.6.3 骨髓有核細胞凋亡率檢測 將制備好的骨髓細胞懸液離心5分鐘,棄上清,PBS洗滌兩次后收集1~5×105個細胞,按試劑盒說明加入Binding Buffer稀釋液輕柔重懸細胞,再依次加入Annexin V-FITC/PI,室溫避光條件下反應10分鐘,1小時內(nèi)用流式細胞儀進行檢測。
1.6.4 免疫組化法檢測骨髓細胞Bcl-2、Bax蛋白表達 切片脫蠟至水,微波抗原修復,3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,3%BSA室溫封閉30分鐘,去除封閉液,滴加一抗Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶200),4℃孵育過夜,滴加二抗(1∶200),室溫孵育50分鐘;DAB顯色;蘇木素復染;脫水,封片。400倍鏡下觀察拍照,采集5個視野。Image-Pro Plus 6.0軟件計算陽性面積,以平均陽性面積作為蛋白表達量,并計算平均光密度值,反映陽性信號的平均深淺。每組隨機選取8只小鼠的骨髓切片進行檢測。
造模前各組小鼠外周血白細胞計數(shù)無明顯差異(P>0.05);治療3天后,模型組與麥粒灸組白細胞計數(shù)均有下降,與空白組比較差異明顯(P<0.01),說明CTX對小鼠細胞毒作用明顯,造模成功,麥粒灸組白細胞計數(shù)要略高于模型組(P<0.05);治療5天后,模型組下降到最低值,而麥粒灸組表現(xiàn)出一定的治療效果,白細胞數(shù)有上升趨勢,與模型組比較差異明顯(P<0.05);在治療7天后,各組小鼠均表現(xiàn)出一定的自愈康復傾向,且麥粒灸組要明顯高于模型組(P<0.01),模型組仍低于空白組(P<0.05)。見表1。
表1 各組CTX小鼠麥粒灸治療前后外周血白細胞計數(shù)比較
治療結束后各組小鼠骨髓切片HE染色結果顯示:空白組造血組織豐富,細胞排列緊密,造血功能旺盛,脂肪細胞數(shù)量較少;模型組小鼠骨髓造血組織破壞嚴重,血細胞生成減少,細胞排列疏松,有核細胞明顯減少;經(jīng)麥粒灸治療后,造血組織有所恢復,骨髓有核細胞數(shù)量明顯增。見圖1。
圖1 各組CTX小鼠骨髓造血組織病理學變化比較(HE染色,×200)
流式細胞儀檢測各組小鼠骨髓有核細胞凋亡率,空白組凋亡率(7.89±0.87)%,模型組凋亡率(23.58±1.98)%,麥粒灸組凋亡率(10.90±1.25)%,空白組、麥粒灸組凋亡率顯著低于模型組(P<0.01),且空白組也顯著低于麥粒灸組(P<0.01)。見圖2。
圖2 各組CTX小鼠骨髓有核細胞凋亡率比較
治療結束后,空白組、麥粒灸組Bcl-2蛋白表達相比無明顯差異(P>0.05),且均高于模型組(P<0.01);麥粒灸組在陽性表達深淺上與空白組、模型組無顯著差異(P>0.05),模型組染色要弱于空白組(P<0.05)。見圖3,表2。
注:棕黃色為陽性染色,藍色為蘇木素染色。
表2 各組CTX小鼠骨髓造血組織Bcl-2蛋白含量比較
Bax蛋白表達方面,模型組明顯高于空白組和麥粒灸組(P<0.01),麥粒灸組表達較空白組也有明顯升高(P<0.01);在陽性表達深淺上,空白組與麥粒灸組無顯著差異(P>0.05),模型組染色程度要深于空白組和麥粒灸組(P<0.01)。見圖4,表3。
注:棕黃色為陽性染色,藍色為蘇木素染色。
表3 各組CTX小鼠骨髓造血組織BAX蛋白含量的比較
中醫(yī)學對于使用化療藥后所造成的白細胞減少、骨髓抑制等情況并無明確記載,但其發(fā)生的病因、病機多為正氣虛損,又遭化學藥物之“外來毒邪”所傷,而致脾腎兩虛,氣血乏源,繼而出現(xiàn)身困乏力、形體羸瘦、納谷不馨、脈虛無力等一系列虛損癥候,據(jù)此可歸于中醫(yī)“虛勞”范疇[13]。《靈樞》所述“髓海不足”則“懈怠安臥”,亦有虛、勞之疾,宜補、宜溫等治則。本研究通過艾灸大椎、足三里、三陰交以拮抗化療后不良反應。督脈大椎與諸陽經(jīng)相交會,具有振陽起痿、祛邪扶正之功;足三里是足陽明之脈所入為合的合土穴,艾灸三里有助氣血生化,充養(yǎng)形體,凡久病元氣衰亡,中虛于內(nèi)所致之疾,均屬本穴主治;三陰交為肝脾腎三經(jīng)交會之處,對其氣化功能失常所致病候具有一定的功效,有補益全身血分之虧虛及通暢全身血液運行的作用[14]。三穴合用,具有助陽化氣,溫補脾腎,調和氣血,固本填髓之功。
Bcl-2基因是一種能抑制細胞凋亡的癌基因,其編碼的Bcl-2蛋白抗凋亡作用明顯,可在線粒體內(nèi)通過調控活性氧水平,有效清除氧自由基,并且使谷胱甘肽更容易進入細胞核內(nèi),改善內(nèi)部氧化還原情況,抑制凋亡。與之相反的Bax蛋白為促凋亡蛋白,當收到凋亡信號時,該蛋白會發(fā)生轉位,通過胞質進入線粒體,與Bcl-2蛋白結合,形成同源二聚體,破壞細胞膜的完整性,激活細胞凋亡信號通路[15]。Bcl-2和Bax蛋白量的多少決定細胞發(fā)生凋亡與否,Bcl-2/Bax值上調則抑制凋亡,下降則促進凋亡[16]。
為探究麥粒灸對細胞凋亡的調節(jié)機制,本實驗應用免疫組化法檢測CTX化療小鼠骨髓內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白表達量。結果顯示,腹腔注射CTX小鼠能很好地模擬化療后出現(xiàn)的白細胞減少、骨髓抑制狀態(tài)。在治療3天、5天時,模型組白細胞仍持續(xù)降低,提示CTX的細胞毒作用呈持續(xù)狀態(tài)。而經(jīng)麥粒灸治療的小鼠有著明顯的拮抗CTX細胞毒作用,白細胞回升提前,這與路玫等[17]實驗結果一致。1周后白細胞數(shù)甚至超過原有水平,且顯效時間較藥物療法明顯縮短[18]。鏡下觀察小鼠骨髓造血組織損害程度減輕,表明麥粒灸對于化療后產(chǎn)生的骨髓抑制確有療效。
為維持骨髓造血細胞正常發(fā)育成熟與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,機體將衰老、異變的細胞通過凋亡途徑予以清除[19]。腹腔注射CTX后,骨髓細胞凋亡率明顯升高,Bax表達增多,Bcl-2/Bax兩者比值降低,骨髓細胞發(fā)生凋亡增多。經(jīng)麥粒灸治療后,骨髓細胞凋亡率有明顯下降,確可逆轉化療后細胞凋亡水平。且Bax表達明顯下降,Bcl-2表達有所增加,比值上調,細胞凋亡率有所減少,提示麥粒灸對于減輕骨髓抑制,降低細胞凋亡率的作用可能與調控Bcl-2、Bax的表達有關。
綜上所述,麥粒灸大椎、足三里、三陰交三穴,可以增加CTX化療小鼠外周血白細胞計數(shù),通過調控Bcl-2/Bax蛋白抑制骨髓細胞的凋亡,減輕小鼠骨髓組織的損傷,恢復骨髓造血功能。