邢小霞，于 鑫，張清明，李平亮

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院山東省植物病蟲(chóng)害綠色防控工程研究中心，山東青島 266109）

種衣劑是由農(nóng)藥成分混合成膜劑等助劑加工制成的藥劑，其有效成分能夠隨種苗的生長(zhǎng)而傳導(dǎo)至地上部分。同作用于葉面噴施或土壤處理農(nóng)藥相比，種衣劑成分與土壤的接觸面積較小，且總用藥量低、持效期長(zhǎng)，降低了對(duì)環(huán)境污染的程度和對(duì)非靶標(biāo)生物的風(fēng)險(xiǎn)[1]。活性成分是種衣劑中的關(guān)鍵性功能成分，其在作物中的分布和消解行為，直接決定了種衣劑的用途和功效。雖然其能起到防蟲(chóng)抑菌的功效，但有效成分還可能對(duì)作物的生長(zhǎng)和環(huán)境造成一定的副作用[2]。例如，施用種衣劑后其造成的藥害，活性成分在作物上的殘留所引起的人畜膳食風(fēng)險(xiǎn)以及在土壤中的殘留造成的環(huán)境污染等[3]。因此，種衣劑有效成分的殘留分布和消解行為是影響其使用方法、作用效果和適用范圍的關(guān)鍵因素，也是了解藥劑作用機(jī)制、持效期和殘留風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，這對(duì)于藥劑的科學(xué)使用具有重要的指導(dǎo)意義。

亮盾是由先正達(dá)開(kāi)發(fā)的一種高效低毒的種衣劑，由精甲霜靈和咯菌腈2種不同作用機(jī)制的殺菌劑組合而成，用來(lái)防治大豆根腐病、水稻惡苗病、棉花立枯病、炭疽病等多種病害[4]。目前，已有報(bào)道精甲霜靈在辣椒、西瓜、西紅柿、煙葉、黃瓜以及馬鈴薯中的殘留動(dòng)態(tài)與降解規(guī)律[5]；咯菌腈在辣椒、櫻桃、葡萄、番茄以及棉花等植株中的殘留動(dòng)態(tài)[6-8]。然而，關(guān)于精甲霜靈與咯菌腈作為種衣劑成分，在大豆植株中殘留分布和降解動(dòng)態(tài)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

大豆是我國(guó)主要的糧油作物，其產(chǎn)量與質(zhì)量關(guān)乎國(guó)家糧食安全。大豆根腐病作為世界性土傳病害，會(huì)危害大豆生產(chǎn)的整個(gè)生命周期，造成大豆產(chǎn)量嚴(yán)重降低，因此研究防治大豆根腐病主要種衣劑在大豆植株中的殘留分布規(guī)律、評(píng)價(jià)其安全性具有重要意義。本研究將商品化農(nóng)藥亮盾（6.25%精甲·咯菌腈種衣劑）應(yīng)用于大豆種子處理，研究其有效成分精甲霜靈和咯菌腈在大豆植株及根圍土壤中的殘留動(dòng)態(tài)，探索藥劑在大豆植株中的內(nèi)吸傳導(dǎo)和降解行為規(guī)律，從殘留降解角度解釋藥劑的作用特點(diǎn)，旨在為該有效成分的種衣劑的科學(xué)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-2030D PLus島津高效液相色譜儀，日本島津公司；渦旋振蕩器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造公司；離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電子天平，西杰天平儀器有限公司。

精甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%），成都化夏化學(xué)試劑有限公司；咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)品（純度97%），上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司；乙腈（分析純），濟(jì)南世紀(jì)通達(dá)化工有限公司；PSA（乙二胺-N-丙基甲硅烷）、弗羅里硅土，博納艾杰爾試劑公司；甲醇（色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)材料

供試品種：大豆品種為‘齊黃28’。

供試藥劑：亮盾（6.25%精甲·咯菌腈）懸浮種衣劑，先正達(dá)中國(guó)投資有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

播種前，將大小一致的大豆種子用6.25%精甲·咯菌腈懸浮種衣劑拌種。根據(jù)包裝推薦劑量，設(shè)定試驗(yàn)的用量為每100 g種子0.40 mL制劑，用蒸餾水稀釋10倍后，均勻覆蓋于種子表面，并小心攪拌，晾干等待播種。將拌有種衣劑的種子種植在盆口直徑為20 cm的花盆中，每盆種10粒種子，并于25℃、光暗比為12∶12、光照強(qiáng)度為20000 lx條件下的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d澆水1次，維持土壤含水量在20%左右。藥劑處理種子種植30盆，以未施用藥劑的大豆種植盆作為對(duì)照，對(duì)照為5盆。根據(jù)大豆植株長(zhǎng)勢(shì)及取樣量的要求，于種植后的1、3、5、7、10和14 d翻土收取大豆種子殘部樣品，取樣量為5 g，取3個(gè)重復(fù)；于7、10、14、21和28 d挖取根系周?chē)寥罉悠罚ㄔ诰嚯x根系5 cm范圍內(nèi)）及大豆整株植物，其中土壤樣品先在通風(fēng)櫥通風(fēng)快速晾干，去除植物根系等雜物后用80目篩成較細(xì)顆粒，取樣量為10 g，取3個(gè)重復(fù)；挖取的大豆植株經(jīng)清洗和晾干后，分離根系和葉片樣品，根、葉樣品取樣量為5 g，取3個(gè)重復(fù)。以上所采集樣品均放置于自封袋，保存于-80℃冰箱。

1.3.2 樣品前處理

大豆樣品提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g液氮磨碎的大豆粉末樣品（種子、植株和根系）置于試管中，加入5 mL二氯甲烷，渦旋震蕩萃取1 min，水浴超聲萃取10 min，隨后在4℃靜置2 h。于5000 r/min離心10 min，加入無(wú)水硫酸鈉1.0 g，取上清液轉(zhuǎn)移至離心管，用氮吹儀在45℃條件下快速吹干。吹干后，先在離心管中加入1.00 mL乙腈，渦旋震蕩1 min，再加入PSA和弗羅里硅土各50 mg，再次渦旋震蕩混勻。隨后于10000 r/min條件下再次離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

土壤樣品提取：稱(chēng)取10.00 g土壤樣品，置于含有10.00 mL乙腈溶劑的試管，渦旋1 min，隨后在4℃靜置2 h。取1.00 mL上清液于離心管中，再分別加入PSA和弗羅里硅土各50 mg，渦旋震蕩混勻，于10000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.3.3 色譜測(cè)定條件

島津InertSustain C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：PDA；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；流速1.0 mL/min。采用梯度洗脫，流動(dòng)相為A（甲醇）和B（超純水）：0～5 min，A：15%；5～9 min，A：15%線 性 增 加 至100%；9～11 min，A：100%線性減少至95%；11～15 min，A：95%線性減少至15%；15～20 min，A：15%。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

在上述色譜測(cè)定條件下，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)分別繪制精甲霜靈和咯菌腈的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法的建立

2.1.1 分析方法的優(yōu)化

大豆、土壤樣品中精甲霜靈和咯菌腈的提取參考已報(bào)道的方法[9]，并將其進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，每毫升大豆植物提取液加入50 mg PSA和50 mg弗羅里硅土?xí)r，2種殺菌劑的加標(biāo)回收率均不低于80%；對(duì)大豆樣品提取液的凈化效果較好，尤其是用于處理根部和葉部樣品時(shí)，加入2種凈化填料可顯著降低提取液的顏色，降低色素相關(guān)雜質(zhì)干擾。

對(duì)于配備紫外檢測(cè)器的液相色譜儀，定量檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇對(duì)于方法的靈敏度和選擇性至關(guān)重要。精甲霜靈和咯菌腈的紫外掃描圖（圖1）表明，2種殺菌劑的紫外信號(hào)強(qiáng)度隨著波長(zhǎng)的增加而減弱，但分別在267和265 nm處有較弱的吸收峰。200 nm處峰信號(hào)較強(qiáng)，但接近溶劑截止波長(zhǎng)，干擾較多，綜合光譜圖中波長(zhǎng)與紫外信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系，確定定量檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

由于精甲霜靈和咯菌腈極性有差異，且凈化劑處理過(guò)的提取液仍有各類(lèi)雜質(zhì)植物代謝成分，可能對(duì)2種殺菌劑的分離形成干擾，所以有必要對(duì)色譜分離參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，采用梯度洗脫方法，峰容量較大，可使得極性、非極性物質(zhì)先后被洗脫，且各個(gè)雜質(zhì)不與精甲霜靈和咯菌腈的峰重合。在最佳儀器條件下，精甲霜靈和咯菌腈標(biāo)樣、大豆提取液空白、大豆提取液添加精甲霜靈和咯菌腈標(biāo)樣、土壤提取液空白和土壤提取液添加精甲霜靈和咯菌腈標(biāo)樣的色譜圖分別見(jiàn)圖2。由圖可知，單個(gè)樣品檢測(cè)的總時(shí)長(zhǎng)為20 min，精甲霜靈和咯菌腈的保留時(shí)間分別為10.99和11.68 min。

2.1.2 方法的線性、靈敏度和回收率

由于大豆種、根、葉均屬植物樣品，為降低方法驗(yàn)證的工作量，本研究將3種未添加殺菌劑的樣品粉末按質(zhì)量比1∶1∶1混合作為大豆基質(zhì)，用于研究和驗(yàn)證方法的定量限、添加回收率等。采用建立的樣品前處理和儀器檢測(cè)方法，對(duì)分析方法的線性范圍、靈敏度和回收率進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，精甲霜靈在0.35～50.0 mg/L范圍內(nèi)的線性方程為y=67503x-12471（R2=0.9912）；咯菌腈在0.15～50.0 mg/L范圍內(nèi)的線性方程為y=117740x+19514（R2=0.9951）。大豆樣品中精甲霜靈和咯菌腈的定量限分別為0.35和0.15 mg/kg；土壤樣品中的定量限則分別為0.20和0.10 mg/kg。此外，大豆和土壤樣品中精甲霜靈的平均回收率為84%～97%；咯菌腈的平均回收率為80%～95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于7%（表1）。以上結(jié)果表明，大豆和土壤基質(zhì)中2種藥劑殘留分析的線性關(guān)系較好，靈敏度和回收率較高，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)需求。

表1 大豆和土壤樣品中精甲霜靈和咯菌腈的添加回收試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.2 殘留降解動(dòng)態(tài)

2.2.1 精甲霜靈的殘留降解動(dòng)態(tài)

精甲霜靈在大豆種子、葉片、根部和根圍土壤中的殘留降解動(dòng)態(tài)如圖3所示。由圖可知，種子、葉片、根中精甲霜靈的初始含量由大到小依次為種子＞根＞葉片；在三者中的含量變化趨勢(shì)均為隨時(shí)間減少，其中在14和21 d時(shí)根、葉中的含量低于檢出限；種子中初期降解速度較快，后期變慢，但總體降解速度慢于根、葉。作為包衣處理的受藥部位，種子中的藥劑成分含量一般最高。大豆種子進(jìn)行包衣處理后，由于施用劑量較大，未能全部滲透進(jìn)入種子內(nèi)部，有一部分精甲霜靈附著于種子表面，保護(hù)種子在發(fā)芽階段免受卵菌等有害病原侵襲，因而種子檢測(cè)到的精甲霜靈應(yīng)是種子內(nèi)外含量之和。精甲霜靈是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)活性較強(qiáng)的殺菌劑，進(jìn)入種子內(nèi)部的藥劑成分會(huì)隨著大豆的發(fā)芽和幼苗的生長(zhǎng)藥劑成分進(jìn)入根、葉等其他部位。相較于葉部，根部含量較大的原因可能是傳導(dǎo)可能存在2種途徑，即種子向根部 的劑量轉(zhuǎn)移，以及根部對(duì)周?chē)寥乐兴巹┑奈铡?/p>

根圍土壤中精甲霜靈也表現(xiàn)隨時(shí)間逐漸降解的特征，但28 d時(shí)仍保持了一定含量。這表明精甲霜靈具有一定的淋溶性，殘留在種子表面的藥劑，會(huì)持續(xù)向周?chē)寥罃U(kuò)散，其含量大小取決于擴(kuò)散至土壤中的速度和土壤中降解速度。擴(kuò)散至土壤中的藥劑，一部分繼續(xù)被附近大豆根系吸收，與從種子轉(zhuǎn)到根系的藥劑一起保護(hù)植株抵抗病原微生物；另一部分被土壤保留。殘留在土壤中的藥劑具有抑制一些土傳病原物的功能，但也可能對(duì)一些有益土壤生物，如蚯蚓，產(chǎn)生危害[10]。

2.2.2 咯菌腈的殘留降解動(dòng)態(tài)

咯菌腈在大豆種子、葉片、根部和根圍土壤中的殘留降解動(dòng)態(tài)如圖4所示。由圖可知，與精甲霜靈一樣，種子中的咯菌腈也呈現(xiàn)含量隨時(shí)間減少的趨勢(shì)，但前3 d降解速度較快，從4.89 mg/kg降至1.82 mg/kg，之后降解速度變緩，至14 d時(shí)仍維持一定含量（0.40 mg/kg）。不同于精甲霜靈的含量變化特點(diǎn)，咯菌腈在根中的含量均表現(xiàn)為先增加、后減少，根部的藥劑平均含量遠(yuǎn)高于葉部。葉部的咯菌腈含量低于精甲霜靈，說(shuō)明精甲霜靈對(duì)葉部的保護(hù)作用相對(duì)較強(qiáng)。根部中咯菌腈含量以較高水平維持較長(zhǎng)時(shí)間，而精甲霜靈在14 d后含量低于定量限，表明保護(hù)根部的主要藥劑成分是咯菌腈。作為一種非內(nèi)吸或弱內(nèi)吸輸導(dǎo)的藥劑，咯菌腈由種子向根的劑量轉(zhuǎn)移主要來(lái)源于根對(duì)根圍土壤藥劑的吸收和附著，而葉片中的較低含量則可能來(lái)源于種子發(fā)芽階段胚芽中的殘留。

根圍土壤中咯菌腈的含量呈現(xiàn)緩慢減少的趨勢(shì)，含量維持相對(duì)穩(wěn)定至28 d（0.583～0.502 mg/kg）。根圍土壤中咯菌腈的含量動(dòng)態(tài)主要與種子表面藥劑脫落擴(kuò)散至土壤中的藥量和藥劑降解速度有關(guān)，還和取樣土壤與種子的距離有關(guān)。根圍土壤中農(nóng)藥的持續(xù)存在，一方面有利于抑制土壤中的病原菌，維持大豆種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的安全環(huán)境；另一方面其殘留也可能影響土壤生態(tài)環(huán)境。

2.2.3 2種有效成分的降解動(dòng)力學(xué)分析

采用已報(bào)道的數(shù)學(xué)模型[11-12]，對(duì)精甲霜靈和咯菌腈在大豆種、葉、根、土中的殘留降解動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合回歸，結(jié)果顯示：精甲霜靈在4種基質(zhì)中的降解動(dòng)態(tài)均各符合一級(jí)農(nóng)藥降解動(dòng)力學(xué)模型Ct=C0e-kt，擬合曲線和擬合方程分別見(jiàn)圖3 A、B、C和D，擬合度（R2）均大于0.84，種、葉、根、土中的半衰期（DT50）分別為1.097、4.884、1.798和13.69 d；咯菌腈在種子、葉片和土壤中的降解動(dòng)態(tài)也符合一級(jí)農(nóng)藥降解動(dòng)力學(xué)模型，擬合曲線和擬合方程分別見(jiàn)圖4A、B和D，但擬合度較差（0.3381＜R2＜0.7476），DT50值分別為1.908、5.698和103.2 d；咯菌腈在根部呈現(xiàn)先增加后減少的特征，符合一級(jí)農(nóng)藥累積-消解動(dòng)力學(xué)模型Ct=IF［t＜tmax，C0ek1t，Cmin+（C0ek1t-Cmin）e-k2（t-tmax）］，擬合曲線見(jiàn)圖5C，擬合方程為Ct=IF［t＜14.11，0.8887e0.07180t，0.9356+（0.8887e0.07180t-0.9356）e-0.1464（t-14.11）］，R2=0.7605，含量峰值為0.8887 mg/kg，達(dá)峰時(shí)的時(shí)間為施藥后14.11 d，峰值后降解半衰期為4.733 d。以上結(jié)果表明，精甲霜靈和咯菌腈在土壤中降解速度最慢，在種子中降解速度最快；咯菌腈在土壤中的殘留期長(zhǎng)于精甲霜靈在土壤中的殘留期，精甲霜靈在葉片中的降解速度慢于根部，咯菌腈在根部有一個(gè)含量峰值，即先累積后降解。

2.2.4 2種有效成分的分布特點(diǎn)

種衣劑防控持效期及其殘留安全性除了與有效成分的初始含量、降解速度和半衰期有關(guān)外，還與在植株不同部位和根圍土壤中的分布密切相關(guān)。本文采用Graphpad Prism進(jìn)行了種植后第7 d 2種有效成分的部位平均含量分布的餅狀圖特點(diǎn)分析。結(jié)圖5所示，精甲霜靈大部分累積于大豆根部（占比73.1%），種子、葉片次之，土壤中最少；咯菌腈同樣主要累積于根部，但占比相對(duì)較低（占比49.8%），其次累積部位是種子，在土壤中的量遠(yuǎn)大于葉部。以上結(jié)果表明，雖然種子部位是種衣劑處理的部位，未種植前承載著100%的藥量，但隨著大豆種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)，2種有效成分可通過(guò)滲透、內(nèi)吸、傳導(dǎo)等多個(gè)途徑進(jìn)入與種子鄰近的根系及根圍土壤，與種子相距相對(duì)較遠(yuǎn)的葉片，維持一定的劑量來(lái)滿(mǎn)足防控病原菌的需求。精甲霜靈的內(nèi)吸傳導(dǎo)性較強(qiáng)，較多地被傳導(dǎo)至根、葉部位；咯菌腈非內(nèi)吸或弱內(nèi)吸，主要?dú)埩粲诜N子表面，而后因土壤水分的淋溶作用進(jìn)入根圍土壤，部分土壤中咯菌腈則進(jìn)一步被根系吸收。

3 結(jié) 論

通過(guò)優(yōu)化前處理步驟和色譜儀器分析參數(shù)，本文建立了大豆植株和根圍土壤中精甲霜靈和咯菌腈的HPLC分析方法。該分析方法線性范圍適中，靈敏度和選擇性較好，回收率滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。將精甲·咯菌腈包衣的大豆種子種植后，2種有效分均可被大豆植株的根、葉所利用，用來(lái)保護(hù)自身的生長(zhǎng)免受大豆病原菌的侵染。其中，精甲霜靈具有較強(qiáng)的內(nèi)吸傳導(dǎo)性，主要保護(hù)大豆葉片，而咯菌腈內(nèi)吸性弱，主要對(duì)根部起保護(hù)作用。種衣劑2種有效成分在大豆植株和根圍土壤中的殘留降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)農(nóng)藥降解動(dòng)力學(xué)或一級(jí)農(nóng)藥累積-降解動(dòng)力學(xué)模型，且兩者在種子中的降解速度最快，而在土壤中降解速度最慢。本研究初步揭示了6.25%精甲·咯菌腈懸浮種衣劑的有效成分精甲霜靈和咯菌腈在大豆植株和根圍土壤中的殘留分布和降解規(guī)律，并從藥劑劑量分布的角度解釋了該藥劑的作用特點(diǎn)，所得研究結(jié)果有助于為指導(dǎo)該藥劑的科學(xué)應(yīng)用提供重要參考。