李 志, 胡代強(qiáng), 付信珍, 張淑敏*, 劉 明*

(1. 濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003； 2. 蘇州普瑞森生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215004)

腫瘤的免疫治療在放療、化療和靶向藥物治療之后，成為治療腫瘤疾病的第三種革命性策略[1]。免疫治療以免疫檢查點(diǎn)抑制劑(Immune checkpoint inhibitors， ICI)[2]的臨床研究最為成熟,且應(yīng)用最為廣泛[3]。ICI治療方法給癌癥患者帶來(lái)新的曙光，但是大量數(shù)據(jù)表明ICI治療只對(duì)部分患者有效，并且9%～29%的患者治療后會(huì)出現(xiàn)腫瘤“超進(jìn)展”現(xiàn)象[4]。因此，如何激活、增強(qiáng)腫瘤的免疫治療應(yīng)答率是腫瘤免疫療法走向廣泛應(yīng)用的難題之一。

腺苷是腫瘤微環(huán)境中免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子[5]，其通過(guò)作用于腺苷受體(Adenosine Receptor，AR)發(fā)揮作用[6-7]。AR是一種G蛋白偶聯(lián)受體(Protein-Coupled Receptor, GPCR)，其在藥理學(xué)中分為4類：A1、 A2a、 A2b和A3[8-9]。其中，A2aR尤為重要，是被廣泛研究的藥物靶點(diǎn)之一[10]。腺苷作為一種免疫抑制代謝物，可以與T細(xì)胞上表達(dá)的A2a受體結(jié)合，而這一結(jié)合會(huì)抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生“免疫逃逸”[11]。A2bR存在于樹突狀細(xì)胞中，在與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞及骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞中高表達(dá)[12]。而阻斷A2bR可以提高免疫細(xì)胞在腫瘤環(huán)境中的免疫應(yīng)答，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。A2受體拮抗劑可以與腺苷競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合A2a或A2b受體，進(jìn)而保持相關(guān)免疫細(xì)胞的免疫活性，保留其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。目前，進(jìn)入臨床的小分子腺苷受體拮抗劑主要包括：PBF-509[13-14]、 PBF-999、 CPI-444[15]、 CS3005和AB928[16]等。這些藥物無(wú)論是單用還是與PD(L)-1聯(lián)用，在腫瘤治療方面都取得了較好的臨床效果。值得注意的是，上述小分子腺苷受體拮抗劑大都只作用于A2aR單靶點(diǎn)，僅有AB928為A2a/A2b雙靶點(diǎn)藥物。

吡啶酮骨架作為一種兼有N-雜環(huán)和酰胺結(jié)構(gòu)單元的化合物，在各種天然產(chǎn)物中都有發(fā)現(xiàn)[17-18]。其整合了多種小分子免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物的設(shè)計(jì)理念，在保留三唑聯(lián)嘧啶胺結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，引入了吡啶酮的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出了一類含有吡啶酮骨架的雙靶點(diǎn)A2腺苷受體拮抗劑。再根據(jù)生物電子等排原理，將這一類化合物衍生為含有吡唑結(jié)構(gòu)的化合物，合成出了6個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的雙靶點(diǎn)A2腺苷受體拮抗劑(Scheme 1)。所得目標(biāo)化合物均經(jīng)1H NMR、13C NMR和HR-MS進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確認(rèn)，采用cAMP法[22]研究目標(biāo)化合物對(duì)A2aR和A2bR的抑制活性。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

X-4A型數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)儀；Bruker AVANCE NEO 600 MHZ型核磁共振儀(CDCl3或DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Thermo Q-Exactive型高分辨質(zhì)譜儀；Waters QDa型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(ESI電離模式)；Waters e2695型高效液相色譜儀；Waters ACQUITY型超高效液相色譜儀。

中間體18、20和21按照文獻(xiàn)[20]方法合成；其余所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 合成

(1)3a～3c的合成(以3a為例)

N2保護(hù)下，將化合物1(800 mg, 6.5 mmol)、甲基環(huán)氧丙烷(2a)(2.34 g, 32.5 mmol)、 Cs2CO3(6.35 g, 19.5 mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(8 mL)中，攪拌下于70 ℃反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，依次用水和乙酸乙酯萃取3次。合并有機(jī)相，用飽和NaCl溶液洗滌、無(wú)水Na2SO4干燥、抽濾、減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：正己烷/乙酸乙酯=3/1，V/V)純化得化合物3a780 mg。

分別以環(huán)丙基硼酸(2b)、 2-碘代丙烷(2c)為原料，用類似的方法合成化合物3b、3c。

3a： 黃色固體，收率62%； MS(ESI)m/z: Calcd for C10H13NO3{[M+H]+}196.10, found 196.16。

3b： 淡黃色固體，收率61%； MS(ESI)m/z: Calcd for C9H9NO2{[M+H]+}164.07, found 164.12。

3c： 黃色固體，收率61%； MS(ESI)m/z: Calcd for C9H11NO2{[M+H]+}166.09, found 166.21。

(2)4a～4c的合成(以4a為例)

將化合物3a(780 mg， 4 mmol)溶于甲醇(10 mL)中，體系降溫至0 ℃，加入NaBH4(228 mg， 6mmol)，于25 ℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后用水和乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相并減壓濃縮除去溶劑，得化合物4a788 mg。用類似的方法合成化合物4b和4c。

4a： 黃色油狀液體，收率100%； MS(ESI)m/z: Calcd for C10H15NO3{[M+H]+}198.11, found 198.21。

4b： 黃褐色油狀液體，收率97%； MS(ESI)m/z: Calcd for C9H11NO2{[M+H]+}166.09, found 166.24。

4c： 棕色油狀液體，收率100%； MS(ESI)m/z: Calcd for C9H13NO2{[M+H]+}168.10, found 166.31。

(3)5a～5c的合成(以5a為例)

N2保護(hù)下，將化合物4a(788 mg, 4 mmol)溶于15 mL無(wú)水四氫呋喃(THF)中，降溫至-5 ℃，依次滴加疊氮磷酸二苯酯(DPPA)(2.2 g, 8 mmol)和1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(DBU)(1.22 g, 8 mmol)，在室溫下反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后用水和乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用飽和NaCl溶液洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，抽濾并減壓濃縮除去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：正己烷/乙酸乙酯=10/1，V/V)純化后得化合物5a400 mg。

用類似的方法合成化合物5b和5c。

5a： 黃色油狀液體，收率45%； MS(ESI)m/z: Calcd for C10H14N4O2{[M+H]+}223.12, found 223.18。

5b： 淡黃色油狀液體，收率51%； MS(ESI)m/z: Calcd for C9H10N4O{[M+H]+}191.09, found 191.21。

5c： 無(wú)色油狀液體，收率52%； MS(ESI)m/z: Calcd for C9H12N4O{[M+H]+}193.11, found 193.22。

(4)8的合成

N2保護(hù)下，依次將化合物6(16.4 g, 0.1 mol)、三異丙基硅基炔(7)(36.5 g, 0.2 mol)、Pd(PPh3)2Cl2(7.0 g, 0.01 mol)、 CuI(1.9 g, 0.01 mol)和三乙胺(30.3 g, 0.3 mol)加入THF溶液(300 mL)中，攪拌下于80 ℃反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后用乙酸乙酯和水萃取3次，合并有機(jī)相并減壓濃縮，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑 ∶二氯甲烷/甲醇=50/1，V/V)純化得20 g化合物8，淡黃色固體，收率64%； MS(ESI)m/z: Calcd for C15H24ClN3Si{[M+H]+}310.15, found 310.21。

(5)10d～10f的合成(以10d為例)

將化合物8(1.55 g， 5 mmol)、 2-氟苯基硼酸頻那醇酯(9d)(1.67 g， 7.5 mmol)、 Pd(dppf)Cl2(350 mg, 0.5 mmol)、 K2CO3(2.07 g, 15 mmol)溶于1,4-二氧六環(huán)(20 mL)和水(5 mL)的混合體系中。N2保護(hù)下，攪拌下于100 ℃反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后用乙酸乙酯和水萃取3次，合并有機(jī)相并減壓濃縮，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：正己烷/乙酸乙酯=5/1，V/V)純化得1.2 g化合物10d。

分別以2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)苯甲腈(9e)、 2-甲基苯硼酸頻那醇酯(9f)為原料，用類似的方法合成化合物10e、10f。

10d： 淡黃色固體，收率65%； MS(ESI)m/z: Calcd for C21H28FN3Si{[M+H]+}370.21, found 370.14。

10e： 淡黃色固體，收率77%； MS(ESI)m/z: Calcd for C23H30N4Si{[M+H]+}391.23, found 391.17。

10f： 黃色固體，收率82%； MS(ESI)m/z: Calcd for C22H31N3Si{[M+H]+}366.24, found 366.31。

(6)11a～11c的合成(以11a為例)

將化合物5a(370 mg, 1 mmol)、化合物10d(333 mg, 1.5 mmol)、碘化亞銅(25 mg, 0.1 mmol)、四丁基氟化銨(TBAF)(523 mg, 2 mmol)溶于t-BuOH(4 mL)和水(4 mL)中，攪拌下于60 ℃反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后用乙酸乙酯和水萃取，合并有機(jī)相，減壓。粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析純化得30 mg化合物11a。

分別以5b、10e和5c、10f為原料，用類似的方法合成化合物11b、11c。

11a： 白色固體，收率51%, m.p.225～226 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.55(s, 1H), 8.02(td,J=7.8 Hz, 1.7 Hz, 1H), 7.67(dd,J=6.8 Hz, 2.1 Hz, 1H), 7.59(d,J=2.3 Hz, 1H), 7.56(m,J=7.8 Hz, 6.9 Hz, 5.1 Hz, 1.9 Hz, 1H), 7.49(dd,J=6.9 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.46～7.20(m, 2H), 6.84(s, 2H), 6.26(t,J=6.8 Hz, 1H), 5.48(s, 2H), 4.77(s, 1H), 3.94(s, 2H), 1.06(s, 6H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 163.32, 160.69, 160.64, 160.57, 160.56, 159.03, 157.71, 144.94, 140.29, 138.83, 131.55, 131.49, 129.74, 129.73, 124.79, 124.71, 124.38, 124.20, 124.14, 124.12, 115.93, 115.78, 104.17, 104.11, 103.43, 69.24, 56.34, 49.17, 26.76; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C22H22N7O2F{[M+H]+}436.1892, found 436.1888。

11b： 白色固體，收率49%, m.p.161～162 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.60(s, 1H), 7.89(dd,J=7.7 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.75(dd,J=7.8 Hz, 1.3 Hz, 1H), 7.61(dd,J=7.0 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.55～7.49(m, 1H), 7.46(dd,J=6.9 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.25(s, 1H), 6.91(s, 2H), 6.24(t,J=6.9 Hz, 1H), 5.48(s, 2H), 3.38(tt,J=7.5 Hz, 4.2 Hz, 1H), 2.54(s, 3H), 1.03～0.95(m, 2H), 0.88～0.81(m, 2H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 166.03, 163.01, 161.49, 157.62, 144.91, 139.40, 138.46, 138.29, 137.52, 133.00, 132.64, 126.34, 124.62, 124.14, 117.39, 112.58, 104.26, 104.04, 48.98, 31.37, 17.64, 5.76; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H20N8O{[M+H]+}425.1833, found 425.1827。

11c： 白色固體，收率54%, m.p.218～219 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.57(s, 1H), 7.81(dd,J=7.0 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.43(dd,J=7.5 Hz, 1.5 Hz, 1H), 7.41(dd,J=6.9 Hz, 1.9 Hz, 1H), 7.35(td,J=7.4 Hz, 1.5 Hz, 1H), 7.33～7.27(m, 2H), 7.23(s, 1H), 6.77(s, 2H), 6.33(t,J=6.9 Hz, 1H), 5.47(s, 2H), 5.09(hept,J=6.8 Hz, 1H), 2.39(s, 3H), 1.29(d,J=6.8 Hz, 6H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 167.71, 163.01, 159.62, 157.11, 145.15, 138.05, 137.76, 134.67, 134.42, 130.10, 128.27, 128.21, 125.25, 124.39, 124.30, 104.73, 104.20, 49.13, 45.72, 20.77, 19.43; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C22H23N7O{[M+H]+}402.2037, found 402.2031。

(7)13g和13h的合成(以13g為例)

將化合物7(1.00 g， 7.93 mmol)加入100 ml三口圓底燒瓶中，用15mL DMF溶解，依次加入K2CO3(2.19 g， 15.86 mmol)和1-氯-2-甲基-2-丙醇(2a)(1.12 g, 10.31 mmol)，于80 ℃反應(yīng)17 h。用水和乙酸乙酯萃取并合并有機(jī)相，用飽和NaCl溶液萃取，無(wú)水Na2SO4干燥，抽濾并減壓濃縮除去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑 ∶正己烷/乙酸乙酯=3/1，V/V)純化得0.617 g化合物13g。

以環(huán)丙基硼酸(2b)為原料，用類似的方法合成13h。

13g： 白色固體，收率39%；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.58(d,J=2.1 Hz, 1H), 6.97(d,J=2.1 Hz, 1H), 4.28(s, 2H), 1.51(s, 6H)； MS(ESI)m/z: Calcd for C9H14N2O3{[M+H]+}199.11, found 199.38。

13h： 類白色固體，收率56%； MS(ESI)m/z: Calcd for C8H10N2O2{[M+H]+}167.08, found 167.28。

(8)14g和14h的合成(以14g為例)

N2保護(hù)下，將LiAlH4(115 mg， 3.03 mmol)溶解于10 ml無(wú)水THF。降溫至0 ℃，將化合物13g(200 mg, 1.01 mmol)的無(wú)水THF溶液轉(zhuǎn)移至上述體系，室溫?cái)嚢? h。反應(yīng)結(jié)束后，將體系降溫至0 ℃，用2M氫氧化鈉溶液0.5 mL淬滅反應(yīng)。用水和乙酸乙酯萃取3次。合并有機(jī)相，用飽和NaCl溶液洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥、抽濾并減壓濃縮除去溶劑得150 mg化合物14g。

以13h為原料，用類似的方法合成14h。

14g： 無(wú)色油狀液體，MS(ESI)m/z: Calcd for C8H14N2O2{[M+H]+}171.11, found 171.28；直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

14h： 淡黃色液體，MS(ESI)m/z: Calcd for C7H10N2O{[M+H]+}139.09, found 139.12；直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

(8)15g和15h的合成

分別以14g、14h為原料，類似于化合物5a的合成步驟，得化合物15g、15h。

15g： 淡黃色液體，收率73.3%；MS(ESI)m/z: Calcd for C8H13N5O{[M+H]+}196.12, found 196.28。

15h： 淡黃色液體，收率66%；MS(ESI)m/z: Calcd for C7H9N5{[M+H]+}164.09, found 164.26。

(9)11d的合成

以化合物15g和10e為原料，類似于化合物11a的合成步驟，得化合物11d。

11d： 白色固體，收率10%, m.p.85～86 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.51(s, 1H), 7.81(d,J=0.8 Hz, 1H), 7.54(d,J=0.7 Hz, 1H), 7.43(dd,J=7.5 Hz, 1.5 Hz, 1H), 7.35(td,J=7.4 Hz, 1.5 Hz, 1H), 7.33～7.27(m, 2H), 7.22(s, 1H), 6.73(s, 2H), 5.56(s, 2H), 4.68(s, 1H), 3.99(s, 2H), 2.39(s, 3H), 1.04(s, 6H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 167.69, 162.98, 157.10, 145.46, 138.02, 137.40, 134.68, 130.44, 130.10, 128.27, 128.22, 125.25, 123.15, 114.25, 104.27, 68.54, 61.42, 43.46, 26.55, 19.43; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C21H24N8O{[M+H]+}405.2146, found 405.2139。

(10)11e和11f的合成(以11e為例)

25 ℃下，將化合物20(100 mg，0.50 mmol)加入50 mL三口圓底燒瓶中。加入1 mL DMF、 5 mL叔丁醇和3 mL水，攪拌溶解。依次加入化合物15g(106 mg，0.55 mmol)、五合水硫酸銅(2.5 mg， 0.01 mmol)和L-抗壞血酸鈉(10 mg， 0.05 mmol)，60 ℃攪拌過(guò)夜。轉(zhuǎn)移至單口瓶濃縮除去溶劑，硅膠柱層析(洗脫劑:二氯甲烷/甲醇=25/1，V/V)得150 mg化合物11e。

以化合物20和15h為原料，用類似方法合成化合物11f。

11e： 類白色固體，收率41%, m.p.173～174 ℃; 1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.51(s, 1H), 7.89(dd,J=7.7 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.75(dd,J=7.7 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.65(d,J=2.3 Hz, 1H), 7.53～7.49(m, 1H), 7.25(s, 1H), 6.87(s, 2H), 6.29(d,J=2.2 Hz, 1H), 5.65(s, 2H), 4.67(s, 1H), 3.99(s, 2H), 2.54(s, 3H), 1.04(s, 6H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 167.10, 164.06, 158.64, 146.31, 145.67, 140.45, 139.55, 134.09, 133.72, 133.06, 127.42, 124.77, 118.47, 113.66, 105.42, 104.97, 69.61, 62.42, 47.77, 27.64, 18.71; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C22H23N9O{[M+H]+}430.2098, found 430.2097。

11f： 淡黃色固體，收率53%, m.p.166～167 ℃; 1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.53(s, 1H), 7.89(dd,J=7.7 Hz, 1.3 Hz, 1H), 7.78～7.73(m, 2H), 7.51(t,J=7.7 Hz, 1H), 7.25(s, 1H), 6.87(s, 2H), 6.26(d,J=2.3 Hz, 1H), 5.62(s, 2H), 3.70(tt,J=7.4 Hz, 3.9 Hz, 1H), 2.54(s, 3H), 1.02～0.93(m, 4H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 167.10, 164.07, 158.62, 146.34, 146.23, 140.45, 139.55, 134.09, 133.72, 131.75, 127.42, 124.91, 118.47, 113.66, 105.44, 105.14, 47.77, 33.14, 18.71, 6.71; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C21H19N9{[M+H]+}398.1836, found 398.1835。

1.3 活性測(cè)試

采用cAMP法分別測(cè)定合成的化合物對(duì)A2a和A2b受體的抑制活性。實(shí)驗(yàn)分別使用CHO-K1/ADORA2a/Gα15穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和CHO-K1/ADORA2b/Gα15穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系[20]。

1.4 分子對(duì)接

利用Discovery Studio 2017 R2軟件，選取人源A2a腺苷受體A2aR-StaR2-bRIL(PDB ID：5IU4)[21]作為受體模型，A2b腺苷受體的蛋白模型是基于(PDB ID： 6PS7)[22]的同源模型，序列同一性61.92%。利用軟件中的CDOCKER模塊進(jìn)行分子對(duì)接研究。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別對(duì)化合物18、13g和11a～11d的實(shí)驗(yàn)條件作了進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果如表1～3所示?；衔?8的合成中，K2CO3的當(dāng)量由3倍當(dāng)量增加至5倍當(dāng)量，堿性增強(qiáng)，有利于催化劑四(三苯基膦)鈀(Pd(PPh3)4)的催化活性提高，從而使反應(yīng)收率得到了提高?；衔?3g的合成中，隨著反應(yīng)溫度的提高，反應(yīng)體系中分子之間的碰撞愈加劇烈，有利于反應(yīng)收率的提高，但當(dāng)溫度升高至95 ℃，化合物12產(chǎn)生了異構(gòu)現(xiàn)象，并發(fā)生了自身的分子內(nèi)成環(huán)反應(yīng)。化合物11a～11d的合成中，一價(jià)銅離子是催化反應(yīng)發(fā)生所必需的。L-抗壞血酸鈉作為配體，先將五合水硫酸銅中的二價(jià)銅離子還原為一價(jià)銅離子，再催化反應(yīng)的發(fā)生。故直接使用碘化亞銅有利于反應(yīng)收率的提高。

表1 化合物18 優(yōu)化條件及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 (a)化合物11e 與A2aR的結(jié)合模式;(c)分子對(duì)接結(jié)果二維作用模式;(b)化合物11e 與A2bR的結(jié)合模式;(d)分子對(duì)接結(jié)果二維作用模式

表2 化合物13g 優(yōu)化條件及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 化合物11a～11d 優(yōu)化條件及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 活性測(cè)試

采用cAMP法在3種不同濃度下測(cè)定了合成的6個(gè)化合物對(duì)A2a受體的抑制活性并計(jì)算抑制率，以AB928做陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果見表4。 6個(gè)化合物對(duì)A2aR受體均表現(xiàn)出不同程度的抑制活性。在1000 nM濃度時(shí)，11b和11e的抑制率最強(qiáng)，分別為96.31%、 96.08%。在100 nM濃度時(shí)，11b和11f對(duì)A2aR受體的抑制率高于陽(yáng)性藥AB928。在10 nM濃度時(shí)，11b、11e和11f和均顯示出了較好的抑制活性，抑制率均高于陽(yáng)性藥AB928。同時(shí)，通過(guò)對(duì)比抑制率，如11c和11d，初步推斷目標(biāo)化合物中含有吡啶酮結(jié)構(gòu)有利于活性的提高。選取了11b、11e和11f三個(gè)目標(biāo)化合物，分別測(cè)定了抑制A2aR和A2bR的IC50值，結(jié)果如表5所示。其中，化合物11e抑制A2aR的IC50值(8.188 nM)與陽(yáng)性藥AB928相當(dāng)，抑制A2bR的IC50值(15.22 nM)明顯小于陽(yáng)性藥AB928。

表4 化合物對(duì)A2a受體的抑制活性

表5 化合物抑制A2aR和A2bR受體的IC50值

2.3 分子對(duì)接

為了明確目標(biāo)化合物與A2a(PDB ID： 5IU4)、 A2b之間的相互作用，使用Discovery Studio 2017 R2軟件對(duì)化合物11e進(jìn)行對(duì)接研究。對(duì)接結(jié)果顯示，化合物11e與A2a(40.2565)、A2b(36.2381)對(duì)接的CDOCKER INTERACTION ENERGY均高于陽(yáng)性藥物AB928(35.3138)，說(shuō)明化合物11e與A2a和A2b靶點(diǎn)具有較好的親和作用?；衔?1e結(jié)構(gòu)中的氰基、亞甲基除了通過(guò)范德華力分別與A2aR的LYS153、GLU169相互作用外，還與LEU249、 VAL84、 ILE274等殘基相互作用。另外，化合物11e結(jié)構(gòu)中的氰基、羥基還可以分別與A2bR的ASN254、 THR89通過(guò)氫鍵相互作用提高與靶標(biāo)的結(jié)合能力。

設(shè)計(jì)并合成了一系列具有吡啶酮或吡唑結(jié)構(gòu)的A2腺苷受體拮抗劑，采用cAMP法研究化合物對(duì)A2aR和A2bR受體的抑制活性，并利用分子對(duì)接模擬化合物11e對(duì)A2a和A2b靶點(diǎn)的結(jié)合情況。結(jié)果表明：化合物11e對(duì)A2aR和A2bR的抑制活性最強(qiáng)，其中對(duì)A2bR的抑制性優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥AB928?；衔?1e是一個(gè)具有廣泛前景的雙靶點(diǎn)(A2a和A2b)腺苷受體拮抗劑，也為小分子免疫檢查點(diǎn)抑制劑的研究與開發(fā)提供了有價(jià)值的借鑒意義。