尹美玲，孫樂，滕李利，宋顏君，許利嘉，肖培根

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所/中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

在快速發(fā)展的社會(huì)，疲勞已成為常見的社會(huì)問題，影響人們的工作效率和生活質(zhì)量[1]。疲勞是指身體極其疲憊的狀態(tài)，包括精神疲勞和體力疲勞[2]。研究發(fā)現(xiàn)體力疲勞的產(chǎn)生與代謝物積累、能量紊亂、機(jī)體氧化應(yīng)激損傷等相關(guān)[3]。

近些年研究發(fā)現(xiàn)，植物來(lái)源的天然產(chǎn)物，如黃酮類化合物，對(duì)改善疲勞有重要作用[4-5]。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是一種天然黃酮，藥理活性廣泛[6-8]。前期文獻(xiàn)報(bào)道DMY具有緩解疲勞的作用，但具體的機(jī)制還有待深入研究[9-11]。結(jié)合本課題組前期研究基礎(chǔ)，本研究采用跑輪實(shí)驗(yàn)和負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)研究DMY 的抗疲勞作用，通過(guò)分析DMY 對(duì)小鼠生化指標(biāo)、能量代謝和氧化應(yīng)激通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，挖掘其抗疲勞的潛在作用機(jī)制，為后續(xù)深入研究提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)ICR 雄性小鼠32 只，4 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0010，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所倫理委員會(huì)審批，審批號(hào)為SLXD-20210115017，飼養(yǎng)于12 h 明暗交替、溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度為（55±10）%環(huán)境中，小鼠自由獲取食物和水，用于后續(xù)跑輪實(shí)驗(yàn)。

SPF 級(jí)ICR 雄性小鼠32 只，體質(zhì)量為18～22 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0006，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所倫理委員會(huì)審批，審批號(hào)為SLXD-20201030014，小鼠飼養(yǎng)于12 h明暗交替的動(dòng)物房?jī)?nèi)，飼養(yǎng)溫度為（23±2）℃，相對(duì)濕度為45%～65%，允許小鼠自由攝食和飲水，用于后續(xù)負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥

DMY（本課題組制備提取，純度為98%）；乳酸（LD）測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒、尿素氮（BUN）測(cè)定試劑盒、肌酸激酶（CK）測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）測(cè)定試劑盒測(cè)定試劑盒（江蘇南京建成生物工程研究所）；TranZol Up Plus RNA kit、TransScipt All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）、PerfectStart ?Green qPCR SuperMix（北京全式金生物科技有限公司）；放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液、超敏熒光化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒（北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗體、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗體、磷酸化AMPK（pAMPK）抗體、核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）抗體（美國(guó)CST 公司）；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）抗體（英國(guó)Abacm 公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，北京索萊寶生物科技有限公司）；肝激酶1（LKB1）、鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶2（CaMKK2）、腺苷酸活化蛋白激酶α2（AMPKα2）、組蛋白去乙酰化酶（SIRT1）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α（PGC-1α）、Nrf2、谷胱甘肽過(guò)氧化酶1（GPx-1）、血紅素家氧酶-1（HO-1）、解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）、PPARα、GAPDH引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）引物序列

1.3 儀器

YLS-10B 型小鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；游泳水箱（自制）；1-14k型高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；Infinite M1000 PRO型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；XMTD-8222型智能數(shù)顯控溫儀（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；AL204 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；G560E Vortex-Genie 2 型渦旋振蕩器（美國(guó)Scientific Industries 公司）；OSE-MC8 型臺(tái)式離心機(jī)[天根生化科技（北京）有限公司]；H2O3-H 型加熱制冷型金屬浴[卡尤迪生物科技（北京）有限公司]；SIM-F140 型制冰機(jī)（日本Sanyo 公司）；NanoPhotometer 型分光光度計(jì)（美國(guó)Implen 公司）；Fastprep-24 ?5G 型快速樣品制備儀（美國(guó)MP Biomedicals 公司）；BE-6100 型微孔板迷你離心機(jī)（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Veriti?型96孔熱循環(huán)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；CFX96 型實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、PowerPac Basic 型電泳儀和ChemiDoc ? Touch Imaging System型蛋白顯影儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 跑輪實(shí)驗(yàn)

2.1.1動(dòng)物分組與給藥 小鼠隨機(jī)分為4 組，分別為對(duì)照組和DMY 低、中、高劑量組，每組8 只。對(duì)照組小鼠每日按體質(zhì)量灌胃給予0.5% CMC-Na（0.01 mL·kg-1）；DMY 溶于0.5% CMC-Na 水溶液中制成混懸液，低、中、高劑量組小鼠分別灌胃20、40、80 mg·kg-1。各組小鼠每日上午給藥1 次，連續(xù)給藥7 d，給藥期間可以自由攝水和飲食。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠注射速眠新麻醉，脫頸椎處死。

2.1.2小鼠跑輪實(shí)驗(yàn) 末次給藥結(jié)束后，將小鼠放進(jìn)帶跑輪系統(tǒng)的機(jī)器中，先以16、20 r·min-1適應(yīng)性訓(xùn)練各15 min，共30 min，再使用24 r·min-1直到小鼠力竭。記錄小鼠在24 r·min-1速度下的跑步力竭距離。

2.2 負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)

2.2.1動(dòng)物分組與給藥 小鼠的分組和給藥劑量設(shè)置同2.1.1項(xiàng)下。

2.2.2小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn) 末次給藥后30 min，在小鼠尾根處系上相當(dāng)于5%體質(zhì)量的鉛絲，依次放入水深約30 cm、水溫為（24±2）℃的游泳箱中游泳。以小鼠頭部沉入水中7 s內(nèi)未浮出水面作為判斷小鼠力竭的標(biāo)準(zhǔn)，記錄此時(shí)間為小鼠的游泳力竭時(shí)間。

2.2.3小鼠血清及組織樣本收集 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，繼續(xù)灌胃給藥2 d，末次給藥后30 min，于2.2.2項(xiàng)下相同游泳裝置中，各組小鼠無(wú)負(fù)重游泳15 min 后注射速眠新麻醉，摘眼球取血，靜置一段時(shí)間，3500 r·min-1離心10 min（離心半徑為0.6 cm），得到血清上清液，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。脫頸椎處死小鼠后取得腿部骨骼肌、肝臟組織，用0.9%氯化鈉溶液浸洗掉血漬，濾紙吸干組織表面水分后，將組織包在錫箔紙中迅速置于液氮，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中冷凍保存。

2.3 血液生化指標(biāo)測(cè)定

采用LD、LDH、CK、BUN 檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明書要求將血清稀釋成合適質(zhì)量濃度，分別檢測(cè)其中LDH、CK活性及LD、BUN含量。

2.4 肌肉LD、肝糖原、肝GSH-Px測(cè)定

稱取適量肌肉和肝臟組織，加入0.9%氯化鈉溶液勻漿，分別采用LD、肌/肝糖原、GSH-Px 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肌肉中LD 和肝臟中糖原的含量，以及肝GSH-Px的活性，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.5 mRNA表達(dá)量檢測(cè)

分別稱取小鼠骨骼肌組織和肝臟組織15～25 mg，加入TranZol 裂解液0.8 mL。按TranZol Up Plus RNA kit 試劑盒說(shuō)明提取總RNA。得到的RNA 樣品取少量用于總RNA的純度和濃度檢測(cè)。按TransScipt All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按PerfectStart?Green qPCR SuperMix 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR。以GAPDH為內(nèi)參基因，mRNA相對(duì)表達(dá)量按2-ΔΔCt計(jì)算。

2.6 相關(guān)蛋白測(cè)定

稱取適量小鼠骨骼肌和肝臟置于裂解液中，冰上裂解30 min 提取總蛋白，12 000 r·min-14 ℃離心20 min（離心半徑為0.6 cm），得到組織上清液，采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定骨骼肌的蛋白質(zhì)量濃度，然后加入1/4體積的loading buffer，95 ℃煮沸蛋白，得到實(shí)驗(yàn)樣品。采用SDS-PAGE 分離樣品，然后將樣品轉(zhuǎn)移到活化的聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加一抗4 ℃冰箱過(guò)夜；次日先用TBST 清洗3 次，每次10 min，然后分別加入對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，再用TBST 洗3 次，每次10 min，隨后用電化學(xué)發(fā)光顯影曝片，并保留相關(guān)條帶，使用Image J 1.4.3 軟件分析計(jì)算各蛋白灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（ˉx±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用單因素方差分析，兩組之間的差異用獨(dú)立的t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用GraphPad Prism 6軟件制圖。

3 結(jié)果

3.1 DMY對(duì)小鼠體質(zhì)量及跑步力竭距離的影響

如表2 所示，在實(shí)驗(yàn)開始前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)照組及DMY各給藥組小鼠組間的體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與初始體質(zhì)量比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠體質(zhì)量有明顯增長(zhǎng)（P＜0.001）。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組小鼠精神狀態(tài)正常、皮毛光滑，沒有打斗痕跡或其他異常狀況。DMY 各劑量對(duì)小鼠的體質(zhì)量及生長(zhǎng)發(fā)育沒有不良影響。與對(duì)照組比較，DMY 各劑量均能顯著延長(zhǎng)小鼠的跑步力竭距離（P＜0.001）。

表2 各組小鼠體質(zhì)量及跑步力竭距離（, n=8）

表2 各組小鼠體質(zhì)量及跑步力竭距離（, n=8）

注：與同組初始體質(zhì)量比較，###P＜0.001；與對(duì)照組比較，***P＜0.001。

3.2 DMY對(duì)小鼠體質(zhì)量及負(fù)重游泳時(shí)間的影響

如表3 所示，負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中，對(duì)照組及DMY各給藥組小鼠在實(shí)驗(yàn)開始前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后組間的體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與初始體質(zhì)量比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠體質(zhì)量明顯增長(zhǎng)（P＜0.01，P＜0.001）。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組小鼠無(wú)異常狀況發(fā)生。與對(duì)照組比較，DMY 各劑量均能不同程度地延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳力竭時(shí)間（P＜0.05，P＜0.001）。

表3 各組小鼠體質(zhì)量及負(fù)重游泳時(shí)間（, n=8）

表3 各組小鼠體質(zhì)量及負(fù)重游泳時(shí)間（, n=8）

注：與同組初始體質(zhì)量比較，##P＜0.01，###P＜0.001；與對(duì)照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。

3.3 DMY 對(duì)小鼠血清LD、LDH、SUN 和CK 水平的影響

結(jié)果如表4 所示，運(yùn)動(dòng)后，與對(duì)照組比較，DMY 各劑量可以顯著降低小鼠血清中LD 水平和LDH 活性（P＜0.05）。DMY 中、高劑量組小鼠的SUN水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）。DMY中劑量組小鼠血清中CK活性顯著低于對(duì)照組小鼠（P＜0.05）。

表4 各組小鼠血清LD、SUN水平和LDH、CK活性（, n=8）

表4 各組小鼠血清LD、SUN水平和LDH、CK活性（, n=8）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；表5～8同。

3.4 DMY對(duì)小鼠肌肉LD、肝糖原和肝GSH-Px水平的影響

結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，DMY 各劑量組小鼠肌肉中LD 水平均降低，其中DMY 低、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；肝糖原水平升高，其中DMY 中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；DMY 高劑量組小鼠肝GSH-Px 活性顯著升高（P＜0.05），見表5。

表5 各組小鼠肌肉LD、肝糖原、肝GSH-Px水平（, n=8）

表5 各組小鼠肌肉LD、肝糖原、肝GSH-Px水平（, n=8）

3.5 DMY 對(duì)小鼠骨骼肌AMPK 信號(hào)通路基因表達(dá)的影響

如表6 所示，與對(duì)照組比較，DMY 各劑量組小鼠骨骼肌中AMPK通路LKB1、CaMKK2、AMPKα2、SIRT1、PGC-1αmRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

表6 各組小鼠骨骼肌AMPK通路蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量（, n=5）

表6 各組小鼠骨骼肌AMPK通路蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量（, n=5）

3.6 DMY 對(duì)小鼠肝臟Nrf2 通路、PPARα 通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

如表7 所示，與對(duì)照組比較，DMY 各劑量組小鼠肝臟中Nrf2、HO-1、GPx-1、PPARα、UCP2 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

表7 各組小鼠肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量（, n=5）

表7 各組小鼠肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量（, n=5）

3.7 DMY 對(duì)小鼠肌肉AMPK 及肝臟Nrf2、PPARα蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示（表8和圖1），DMY 可以顯著增加小鼠肌肉中pAMPK/AMPK的比值，激活了AMPK信號(hào)通路（P＜0.01）。此外，DMY也可以顯著增加小鼠肝臟Nrf2、PPARα蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠肌肉AMPK和肝臟Nrf2、PPARα蛋白表達(dá)

表8 各組小鼠肌肉pAMPK/AMPK和肝臟Nrf2、PPARα蛋白相對(duì)表達(dá)量（, n=3）

表8 各組小鼠肌肉pAMPK/AMPK和肝臟Nrf2、PPARα蛋白相對(duì)表達(dá)量（, n=3）

4 討論

DMY 是一種黃酮類化合物，前期文獻(xiàn)報(bào)道其具有緩解疲勞的作用，但具體的機(jī)制還有待深入研究[9-11]。運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生疲勞，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)疲勞的產(chǎn)生與體內(nèi)代謝物堆積、能量損耗、氧化應(yīng)激等因素有關(guān)[12-13]。疲勞最直接的體現(xiàn)就是運(yùn)動(dòng)耐力的下降[14]，跑輪實(shí)驗(yàn)、負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)等常作為小鼠耐力和疲勞狀態(tài)等指標(biāo)的評(píng)價(jià)方法[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用跑輪實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃拓?fù)重力竭游泳模型驗(yàn)證DMY的抗疲勞作用，并對(duì)其緩解疲勞的機(jī)制深入研究。研究結(jié)果表明，DMY 顯著延長(zhǎng)了小鼠跑步力竭距離和負(fù)重游泳力竭時(shí)間，對(duì)提高小鼠運(yùn)動(dòng)耐力及緩解體力疲勞有顯著作用。

葡萄糖是肌肉活動(dòng)時(shí)能量的主要來(lái)源，主要以糖原的形式儲(chǔ)存在肝臟和肌肉中[16]。糖原的含量與機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力有密切關(guān)系。機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌糖原直接消耗提供能量，隨著肌糖原逐漸減少，為了維持血糖穩(wěn)定，肝糖原會(huì)分解成葡萄糖，如果肝糖原耗竭，血糖明顯下降，運(yùn)動(dòng)不能繼續(xù)，因此肝糖原的儲(chǔ)量直接反映機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力的水平。肝糖原儲(chǔ)備越多，運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，運(yùn)動(dòng)耐力越強(qiáng)，抗疲勞作用越強(qiáng)[17]。運(yùn)動(dòng)后，DMY 各組小鼠的肝糖原水平顯著高于對(duì)照組，證明了DMY緩解疲勞的有效性。

當(dāng)劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體呈現(xiàn)相對(duì)無(wú)氧狀態(tài)，肌肉糖酵解供能占主導(dǎo)，肌肉和血液中積累大量LD，同時(shí)LDH 控制著肌肉LD 的代謝反應(yīng)，LD 增多，H+濃度增加，引起機(jī)體神經(jīng)傳導(dǎo)、糖酵解及肌肉收縮等功能障礙，影響能量的產(chǎn)生、釋放和儲(chǔ)存，進(jìn)一步導(dǎo)致疲勞發(fā)生[18-19]。當(dāng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，糖和脂肪酸的氧化無(wú)法滿足能量供應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)和氨基酸代謝增加維持能量供應(yīng)，導(dǎo)致血清BUN 含量增加，反映機(jī)體對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)能力較差。此外，血清BUN 的含量越少，也說(shuō)明機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝參與供能較少，糖和脂肪類能源物質(zhì)供應(yīng)充足，這可以與肝糖原的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相印證。另外，血清中CK 的含量是反映機(jī)體過(guò)度勞累及間接反映肌肉損傷的重要指標(biāo)。CK的活性升高，提示肌肉受損及機(jī)體疲勞[20-21]。與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似，本研究結(jié)果證明，DMY 可以顯著降低疲勞小鼠肌肉LD，血清LD、SUN 的含量，降低血清LDH 和CK 的活性，具有緩解疲勞的作用，改善了疲勞小鼠的能量代謝水平。

AMPK 途徑在機(jī)體的能量合成和代謝中有重要作用。在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，肌肉中的AMPK 受上游AMPK 激酶，包括肝激酶1（LKB1）和鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶1（CaMKK1）和CaMKK2 的調(diào)節(jié)[22]。AMPK 下游的SIRT1 是一種煙堿腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性的蛋白去乙?；福瑓⑴c調(diào)節(jié)生物代謝過(guò)程，可以激活PGC-1α基因表達(dá)[20]，從而調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、葡萄糖攝取及線粒體的生物合成[23]。本研究結(jié)果表明，DMY 顯著增加LBK1、CaMKK2 mRNA 表達(dá)，激活A(yù)MPKα2 及下游SIRT1和PGC-1αmRNA 的表達(dá)，并且顯著增加了AMPK磷酸化水平，表明DMY 可能激活了AMPK 能量代謝途徑，為肌肉運(yùn)動(dòng)提供更多能量。

當(dāng)劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生大量活性氧（ROS）自由基，影響機(jī)體生物大分子的氧化，從而加速疲勞的產(chǎn)生[24]。此時(shí)，機(jī)體的抗氧化能力對(duì)于緩解機(jī)體疲勞有重要作用。肝臟是體內(nèi)代謝的重要器官，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，除儲(chǔ)存糖原外，也參與調(diào)節(jié)GSH-Px 等抗氧化酶的分泌。GSH-Px 是一種機(jī)體廣泛存在的過(guò)氧化物分解酶，可以清除ROS 等代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化平衡，保護(hù)細(xì)胞正常功能[25-26]。本研究表明，DMY 高劑量可以增加抗氧化酶GSH-Px 活性，提示DMY 抗氧化的作用機(jī)制可能與GSH-Px 的促分泌有關(guān)。進(jìn)一步探討DMY抗氧化的可能作用機(jī)制，Nrf2 是細(xì)胞抗氧化的重要因子，其活化后進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，激活下游HO-1、GPx-1等抗氧化基因表達(dá)及抗氧化酶GSH-Px 的分泌[3]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DMY 可以顯著上調(diào)肝臟Nrf2、HO-1和GPx-1基因的表達(dá)及顯著增加肝Nrf2 蛋白的表達(dá)，提示DMY 可能作用Nrf2相關(guān)通路發(fā)揮抗氧化作用。

此外，PPAR 是一類激素受體，其中PPARα的表達(dá)可以增強(qiáng)機(jī)體的氧化能力，改善脂質(zhì)代謝[27]，并且PPARα可以調(diào)控下游UCP2 的分泌，在線粒體的氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[28]。已有文獻(xiàn)報(bào)道DMY可以上調(diào)疲勞小鼠肌肉中PGC-1α和PPARα基因表達(dá)[10]。在本研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DMY 可以顯著上調(diào)肝臟PPARα和UCP2基因表達(dá)，并且其顯著上調(diào)了肝PPARα蛋白表達(dá)，提示DMY 可能作用PPARα相關(guān)通路提高疲勞小鼠抗氧化的能力。

綜上所述，DMY 可能通過(guò)激活肌肉AMPK 通路及肝Nrf2 和PPARα相關(guān)通路改善小鼠疲勞。本研究報(bào)道了DMY 對(duì)上調(diào)Nrf2 和PPARα蛋白表達(dá)的顯著作用，為DMY 抗疲勞的機(jī)制探索提供了參考，相關(guān)的機(jī)制研究仍需深入，以助力DMY 的深度開發(fā)。