張艷萍，李 娜

內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市中心醫(yī)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)超聲影像研究所兒科,內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017010

哮喘是由肥大細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞等多種炎性細胞參與的一類非特異性炎癥，主要臨床特征為可逆性氣道阻塞、氣道高反應性及氣道炎癥[1]?；颊吲R床表現(xiàn)為反復咳嗽、氣急、胸悶、喘息等，嚴重威脅患者生命健康[2-3]。流行病學資料顯示，哮喘高發(fā)于兒童，且隨著社會發(fā)展，兒童發(fā)病率呈逐年上升趨勢[4-6]。目前，哮喘的總體控制率并不佳，探討有效的生物標志物用于評估病情十分必要。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA 分子，主要通過抑制翻譯或降解靶標信使RNA反應等過程從而調(diào)節(jié)機體基因表達。miRNA在細胞增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。研究證實，miRNA可參與氣道變應性炎癥的發(fā)病過程，在哮喘患兒支氣管肺泡灌洗液中多種miRNA呈異常表達[9]。miR-7b是近年來引發(fā)關注的熱點miRNA之一，其在炎性反應過程中發(fā)揮著關鍵作用，但關于哮喘患兒miR-7b表達的臨床意義報道尚少。血清外泌體是一類直徑為30～200 nm的脂質(zhì)雙層膜結構微小囊泡，在炎性反應、免疫監(jiān)視等過程中起著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，血清外泌體存在豐富的特異性miRNA，且穩(wěn)定性好[10]?；诖耍狙芯刻接懥讼純和饷隗w中miR-7b水平及與肺功能的關系，并分析miR-7b在評估患者病情中的臨床價值，旨在為哮喘患兒的臨床治療提供相關依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016-2021年本院收治的101例哮喘患兒為研究對象。哮喘診斷及分期參考《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[11]。根據(jù)患兒病情，將101例患兒分為急性發(fā)作期組(40例)和臨床緩解期組(61例)，選擇同期101例體檢健康兒童為對照組。所有研究對象監(jiān)護人知情且同意。本研究通過本院倫理委員會批準。哮喘患兒納入標準：(1)年齡為6～12歲；(2)初次患??；(3)臨床資料完整。哮喘患兒排除標準：(1)合并其他呼吸系統(tǒng)疾??；(2)合并心、肝、腎等其他器官組織疾病者；(3)有過敏性疾病史或哮喘家族史者；(4)近3個月內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素等可能影響實驗結局者。對照組納入標準：(1)年齡為6～12歲；(2)近1個月內(nèi)體檢健康。

1.2方法

1.2.1外泌體提取 所有研究對象均于入組時空腹抽取靜脈血5 mL，采用體液外泌體提取試劑盒(北京鼎國生物科技有限公司)提取血清外泌體：室溫下靜置靜脈血30 min，隨后以2 000×g離心10 min，取上層血清，經(jīng)過0.22 μm過濾器過濾后，將500 μL血清與5 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)混勻，以100 000×g離心70 min，棄上清液后用PBS洗滌重懸，以100 000×g離心70 min后加入100 μL PBS重懸外泌體。

1.2.2RT-PCR檢測 采用RNA提取試劑盒(美國Abcam公司)提取外泌體RNA，并根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Abcam公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應，根據(jù)SYBR RT-PCR試劑盒(中國杭州博日科技有限公司)說明書進行RT-PCR(TC100 PCR儀，美國Bio-Rad公司)實驗。反應體系為：95 ℃ 預變性 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)35 次。采用2-ΔΔCt法來測定各組miR-7b相對表達量，內(nèi)參為U6，每個樣本重復3次，取平均值。引物由中國北京鼎國生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 所有研究對象均于入組時空腹抽取靜脈血5 mL，分離血清后采用ELISA(Hamilton microlab star 多功能酶標儀，瑞士Hamilton公司)檢測白細胞介素(IL)-4、IL-6、γ干擾素(IFN-γ)、免疫球蛋白E(IgE)水平，試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2.4肺功能檢測 所有研究對象均于入組時采用德國耶格MasterScreen IOS肺功能檢測儀檢測肺功能，包括第一秒用力呼氣量(FEV1)、用力肺活量(FVC)、FEV1/FVC。

1.3觀察指標 主要指標：(1)比較急性發(fā)作期組、臨床緩解期組及對照組血清外泌體miR-7b、FVC、FEV1、FEV1/FVC水平；(2)分析哮喘患兒miR-7b水平與FVC、FEV1、FEV1/FVC的相關性；(3)分析miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平在患兒病情評估中的臨床價值。次要指標：(1)比較急性發(fā)作期組、臨床緩解期組及對照組血清IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平；(2)比較治療前后哮喘患兒miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平；(3)分析哮喘患兒miR-7b水平與IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平的相關性。

2 結 果

2.1外泌體鑒定結果 通過透射電子顯微鏡可觀察到血清外泌體呈圓形或橢圓形，見圖1。

圖1 透射電子顯微鏡下外泌體(標尺=100 nm)

2.23組一般資料比較 3組在年齡、性別構成及體質(zhì)量等一般資料上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 3組一般資料比較(n或

2.33組miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平比較 相較于對照組，急性發(fā)作期組及臨床緩解期組miR-7b、IL-4、IL-6、IgE水平更高，而IFN-γ水平更低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與臨床緩解期組比較，急性發(fā)作期組患兒miR-7b、IL-4、IL-6、IgE水平有所上升，而IFN-γ水平有所下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平比較

2.43組肺功能水平比較 相較于對照組，急性發(fā)作期組及臨床緩解期組FVC、FEV1、FEV1/FVC水平更低(P<0.05)；與臨床緩解期組比較，急性發(fā)作期組患兒FVC、FEV1、FEV1/FVC有所下降(P<0.05)，見表4。

表4 3組肺功能水平比較

2.5哮喘患兒miR-7b水平與IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE及肺功能的相關性 相關性分析結果顯示，哮喘患兒miR-7b水平與IL-4、IL-6、IgE水平呈正相關(r=0.345、0.392、0.496,P<0.05)，而與IFN-γ、FVC、FEV1、FEV1/FVC呈負相關(r=-0.383、-0.416、-0.452、-0.392,P<0.05)，見表5。

表5 哮喘患兒miR-7b水平與IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE及肺功能水平的相關性

2.6治療前后哮喘患兒miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平變化情況 治療后，哮喘患兒miR-7b、IL-4、IL-6、IgE水平有所下降，而IFN-γ水平有所上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 治療前后哮喘患兒miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平變化情況

2.7ROC曲線分析結果 IL-4的曲線下面積(AUC)為0.67，截斷值為186.33 ng/L；IL-6的AUC為0.73，截斷值為45.24 ng/L；INF-γ的AUC為0.77，截斷值為48.37 ng/L；IgE的AUC為0.76，截斷值為261.78 IU/mL；miR-7b的AUC為0.89，截斷值為3.42；聯(lián)合檢測的AUC最大，為0.92。見表7。

表7 ROC曲線分析結果

3 討 論

哮喘是我國常見的兒童慢性疾病之一，隨著環(huán)境污染問題日益嚴重，我國哮喘患兒發(fā)病率快速上升，及時診斷及評估患兒病情十分重要[12-14]。目前，關于哮喘的發(fā)病機制尚不明確，有學者認為，輔助性T淋巴細胞(Th)1/Th2失衡在哮喘發(fā)生、發(fā)展過程中起著關鍵作用[1]。哮喘患兒免疫功能下降、外源性致敏原被抗原遞呈細胞吞噬并促進T細胞的激活，導致大量炎性因子的釋放，進而促使氣道平滑肌收縮、氣道壁細胞分泌物增多，最終引發(fā)臨床癥狀[15]。此外，免疫功能下降還可促進Th2細胞活化，進而激活免疫細胞聚集，吞噬炎性細胞，同時釋放大量炎性因子。本研究結果顯示，相較于健康兒童，臨床緩解期及急性發(fā)作期哮喘患兒IL-4、IL-6、IgE水平均有所上升，而IFN-γ水平有所下降，且急性發(fā)作期患兒IL-4、IL-6、IgE水平顯著高于臨床緩解期患兒，而IFN-γ水平顯著低于臨床緩解期患兒，且通過治療后各指標水平均有所改善。這與既往研究結果較為一致，說明哮喘患兒存在炎性因子水平異常，且病情越嚴重患兒炎性因子表達異常程度也有所增加。

miRNAs是一類長度為17～25個核苷酸的非編碼RNA，其不能編碼蛋白質(zhì)，主要作用機制為通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)相結合從而對靶基因的表達進行負反饋。近年來，隨著研究的深入，已有大量研究證實miRNA在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵作用[16-17]。研究報道，miR-125b在哮喘患兒中呈異常表達，并與患兒病情嚴重程度密切相關，提示miRNA可作為診斷及鑒別哮喘的生物標志物之一[18]。miR-7b是近年來研究較為廣泛的miRNA之一，在生物進化過程中高度保守，并高表達于血液系統(tǒng)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-7b可通過促進或抑制炎性因子的表達進而參與肺部炎性反應損傷及修復過程，因此推測miR-7b可能參與哮喘的發(fā)病過程[19]。血清外泌體可由免疫細胞、癌細胞等多種細胞分泌，包含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等成分。研究表明，外周血中的核酸序列容易受到外源物、核酶等物質(zhì)的影響，導致RNA難以穩(wěn)定存在于外周血中，而相較于外周血，外泌體的核酸序列具有較高的穩(wěn)定性，且不易受到外界物質(zhì)的干擾，已被醫(yī)學研究者認為是診斷疾病的理想生物標志物之一[20]。本研究結果顯示，相較于健康兒童，哮喘患兒血清外泌體miR-7b水平顯著上升，且急性發(fā)作期患兒miR-7b水平顯著高于臨床緩解期患兒，而通過治療后哮喘患兒miR-7b表達水平有所下降，這提示哮喘患兒存在miR-7b異常。肺功能指標FVC、FEV1、FEV1/FVC是評價哮喘嚴重程度及療效的指標之一，研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒存在FVC、FEV1、FEV1/FVC異常。而相關性分析結果顯示，哮喘患兒miR-7b水平與IL-4、IL-6、IgE水平呈正相關，而與IFN-γ、FVC、FEV1、FEV1/FVC水平呈負相關。這也進一步說明miR-7b與哮喘患兒肺功能及炎性反應密切相關。

本研究進一步采用ROC曲線分析相關指標在患者病情評估中的臨床價值，結果顯示，IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平單獨評估患者病情的AUC均<0.80，且靈敏度及特異度不高。而miR-7b及聯(lián)合檢測評估患者病情的AUC均>0.80，且均具有較高的靈敏度及特異度，提示具有一定的臨床價值。

但本研究也存在一定不足，如樣本來源于單中心，導致樣本量較小，可能導致結果出現(xiàn)一定偏倚。因此，仍需后續(xù)研究進一步加以探討。

綜上所述，哮喘患兒血清外泌體miR-7b水平顯著上升，并與患兒炎性反應及肺功能密切相關。miR-7b水平在輔助評估哮喘患兒病情中具有一定的臨床價值。