樓天靈，袁莉霞，張國(guó)芳，吳 浩，沈 嵐

(1.浙江藥科職業(yè)大學(xué)，浙江 寧波 315100; 2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315100)

鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)是多年生草本植物，屬于蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)，是一種傳統(tǒng)的名貴中草藥。其具有益胃生津、滋陰清熱之功效，富含多糖及幾十種微量元素，素有“千金草”“神仙草”之稱[1]。近年來，通過藥理及有效成分分析發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛中的有效成分主要為多糖類物質(zhì)，能提高免疫力，降低血糖，抗氧自由基及保護(hù)胃等功效[2]。隨著中藥在臨床用藥中的增加，野生資源的過度開采，野生資源蘊(yùn)藏量顯著下降，難以滿足加工和臨床使用的需求。人工種養(yǎng)規(guī)模和產(chǎn)區(qū)范圍隨之均逐步擴(kuò)大，藥材質(zhì)量不穩(wěn)定、品種退化問題也隨之嚴(yán)峻。因此，篩選培育優(yōu)良種源，擴(kuò)大新的藥源迫在眉睫。而植物物種間的遺傳親緣關(guān)系越接近，其所含的化學(xué)有效成分類型及含量也越相近[3]，能較快地發(fā)現(xiàn)新藥源[4]。但目前有關(guān)鐵皮石斛的研究主要集中于藥理藥效、有效成分分析等方面[5-6]，系統(tǒng)發(fā)育方面的研究較少。

葉綠體在植物細(xì)胞中起著至關(guān)重要的作用，能進(jìn)行植物的光合作用，具有一套自主的遺傳物質(zhì)，有研究表明，其源于內(nèi)共生藍(lán)藻[7]。大量研究表明，多數(shù)被子植物的葉綠體基因組為雙鏈環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)[8]，大單拷貝區(qū)(Large Single Copy Region, LSC)、小單拷貝區(qū)(Small Single Copy Region, SSC)和反向重復(fù)區(qū)(Inverted Repeat Regions, IRa/IRb)。葉綠體基因組較核基因組及線粒體基因組更為保守，其長(zhǎng)度在120～160 kb之間，總基因個(gè)數(shù)約為130個(gè)[9]，具有單親遺傳不存在重組、序列變異度適中等特點(diǎn)[10]。近年來，隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，葉綠體基因組的研究也越來越多，自1986年煙草[11]和地錢[12]首次公布以來，已有超3 000條葉綠體基因組被公布[13]。

本研究基于Illumina二代測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)方法，分析了鐵皮石斛的葉綠體基因組全序列測(cè)序、基因功能注釋、圖譜構(gòu)建，并對(duì)其結(jié)構(gòu)特征作出解析。選取了已發(fā)表的13個(gè)蘭科植物以及2個(gè)外類群葉綠體基因組序列，做了親緣關(guān)系分析，為鐵皮石斛的藥用資源開發(fā)、遺傳多樣性、種間系統(tǒng)親緣關(guān)系及新藥源的開發(fā)等研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

鐵皮石斛樣品采集自寧波市寧?？h小宋村1個(gè)野生居群，由浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院沈嵐高級(jí)農(nóng)藝師鑒定。標(biāo)本存放于浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院石斛種質(zhì)資源庫中。

1.2 DNA提取

取鮮嫩幼葉約2 g，液氮冷凍研磨至粉末，利用植物基因組DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)，參照說明書完成提取。根據(jù)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳的條帶亮度及Nanodrop 1000檢測(cè)的D260/D280的比值和濃度，經(jīng)檢驗(yàn)合格的樣本送生工生物工程(上海)股份有限公司，通過Illumina HiSeq 2500-PE 150平臺(tái)進(jìn)行建庫測(cè)序。

1.3 葉綠體基因組測(cè)序

DNA質(zhì)量檢測(cè)合格后，通過超聲波的方法將其破碎，純化并修復(fù)破碎的DNA片段，完成3′-端加ployA處理，連接測(cè)序頭[14]，并利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，區(qū)分不同大小的片段，完成PCR擴(kuò)增。通過基因文庫質(zhì)檢，獲得基因測(cè)序文庫。經(jīng)檢測(cè)合格的文庫利用Illumina Hi Seq 2500完成基因測(cè)序。

1.4 基因組組裝及基因功能注釋

對(duì)Illumina測(cè)序獲得的原始測(cè)序文件數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，利用NGS QC ToolKit[15]除去測(cè)序接頭以及低質(zhì)量的片段，盡可能保證序列的準(zhǔn)確性，獲得高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果。采用NOVOPlasty軟件[16]，設(shè)定K-mer值為39，參考蘭科石斛屬石斛Dendrobiumnobile(Genebank No.：KX 377961.1)的葉綠體基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KX 377961.1/)的保守序列對(duì)鐵皮石斛的葉綠體基因組進(jìn)行組裝，獲得完整的葉綠體基因組。得到的葉綠體組基因用Mitofy[17]完成基因功能注釋并利用CpGAVASpipeline[18]進(jìn)行準(zhǔn)確性驗(yàn)證。最后再利用在線工具OGDraw[19](https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)繪制鐵皮石斛的葉綠體基因組物理圖譜，并上傳至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，獲得登錄號(hào)(MZ 129032)。

1.5 重復(fù)序列與SSR序列分析

利用在線軟件REPuter[20](https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer)驗(yàn)證鐵皮石斛的重復(fù)序列：正向重復(fù)序列(F)、反向重復(fù)序列(R)、正向互補(bǔ)序列(C)和回文序列(P)，參數(shù)設(shè)置為：Minimal repeat size=30，Hamming distance=3；以及利用在線軟件MISA[21](http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)檢測(cè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR),設(shè)置參數(shù)為：?jiǎn)魏塑账嶂貜?fù)≥10，二核苷酸重復(fù)≥5，三核苷酸重復(fù)≥4，四核苷酸重復(fù)≥3，五核苷酸及六核苷酸重復(fù)≥3。所有搜索得到的序列結(jié)果均通過人工予以驗(yàn)證。

1.6 葉綠體全基因組比對(duì)分析

利用在線軟件VISTA[22](http://genome.lbl.gov/vista/mvista/instructions.shtml)中的mVISTA工具對(duì)鐵皮石斛及石斛屬的其他3個(gè)物種(霍山石斛Dendrobiumhuoshanense、細(xì)莖石斛Dendrobiummoniliforme、石斛Dendrobiumnobile)的葉綠體全基因組進(jìn)行對(duì)比分析并繪制比對(duì)圖。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了解鐵皮石斛在蘭科植物中的系統(tǒng)位置，從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中下載了13個(gè)已發(fā)表的蘭科葉綠體基因組，2個(gè)百合科植物(外類群)，分別為：長(zhǎng)距蝦脊蘭(CalanthesylvaticaNC 044633)、通麥蝦脊蘭(CalanthegriffithiiMZ 474966)、伏生石豆蘭(BulbophyllumreptansMW 800884)、杜鵑蘭(CremastraappendiculataNC 037439)、霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseMN 617016)、細(xì)莖石斛(DendrobiummoniliformeMN 617018)、石斛(DendrobiumnobileKX 377961)、沼蘭(LiparisjaponicaMK 886513)、箬葉蘭(SobraliacallosaKM 032623)、疏花火燒蘭(EpipactisveratrifoliaNC 030708)、大葉火燒蘭(EpipactismaireiNC030705)、日本對(duì)葉蘭(NeottiajaponicaMH 321184)、小葉兜蘭(PaphiopedilumbarbigerumNC 050870)，蒜(AlliumsativumMK 335928)、韭(AlliumtuberosumNC 044709)，與鐵皮石斛葉綠體基因組，通過MAFFT軟件[23]完成基因組序列的比對(duì)，再利用MEGA 7.0軟件[24]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，確定鐵皮石斛與其他蘭科植物之間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛葉綠體基因組基本特征

通過Illumina Hi Seq 2500平臺(tái)獲得6.98 GB的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)，鐵皮石斛葉綠體基因組結(jié)構(gòu)與大多數(shù)被子植物類似，為雙鏈環(huán)狀的四分體結(jié)構(gòu)(圖1)，其大小為153 508 bp，大單拷貝區(qū)域(LSC)為85 759 bp，小單拷貝區(qū)域(SSC)為14 973 bp，兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)域(IRs)為26 419 bp。

在鐵皮石斛葉綠體基因組中共被注釋了133個(gè)基因，其中包括93個(gè)蛋白編碼基因(CDS)，32個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)基因以及8個(gè)核糖體rRNA(rRNA)基因(表1)。并對(duì)其堿基組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GC的含量占總共堿基數(shù)量的37.51%，其中LSC區(qū)域?qū)?yīng)的百分比為35.13%，SSC區(qū)域?qū)?yīng)的百分比為30.24%、IRa區(qū)域?qū)?yīng)的百分比為43.35%和IRb區(qū)域?qū)?yīng)的百分比為43.35%。

表1 鐵皮石斛葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征Table 1 Structural characteristics of Dendrobium candidum chloroplast genome

2.2 重復(fù)序列分析

本研究利用在線軟件REPuter檢測(cè)了長(zhǎng)重復(fù)序列(長(zhǎng)度≥30 bp)，鐵皮石斛共檢測(cè)到47個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列，其中正向重復(fù)序列19個(gè)，反向重復(fù)序列20個(gè)，互補(bǔ)重復(fù)序列8個(gè)，其間隔序列大小均在30～50 bp之間(表2)。利用在線軟件MISA檢測(cè)鐵皮石斛葉綠體基因組中簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)，共檢測(cè)到簡(jiǎn)單重復(fù)序列63個(gè)，其中單核重復(fù)序列(A/C/T/G)36個(gè)，二核苷酸重復(fù)序列(AT/GA/TA/TC)15個(gè)，三核苷酸重復(fù)序列(ATA/TAG/TAT)5個(gè)，四核苷酸重復(fù)序列(AGAA/ATTA/CTAT/GTCT/TAGT) 5個(gè)，五核苷酸重復(fù)序列(TCTAT)1個(gè)、六核苷酸重復(fù)序列(TCCATC)1個(gè)(表2、表3)。

表2 鐵皮石斛葉綠體基因組中長(zhǎng)重復(fù)序列與SSR數(shù)量Table 2 The long repetitive sequences and SSR numbers of Dendrobium candidum chloroplast genomes 單位：個(gè)

表3 鐵皮石斛葉綠體基因組中SSR類型Table 3 SSR types of Dendrobium candidum chloroplast genomes

圖1 鐵皮石斛完整的葉綠體基因組圖譜Fig.1 The whole chloroplast genome map of Dendrobium candidum

2.3 葉綠體全基因組比對(duì)分析

以已注釋的鐵皮石斛葉綠體基因組序列(登錄號(hào): MZ 129032)為參考，再通過在線軟件工具 mVISTA 對(duì)鐵皮石斛及石斛屬的其他3個(gè)物種的葉綠體基因組進(jìn)行全基因組比較分析，結(jié)果(圖2)顯示4個(gè)葉綠體基因組均具有高度保守序列，且大部分變異均處于非編碼區(qū)。

圖2 霍山石斛、細(xì)莖石斛、石斛及鐵皮石斛的葉綠體基因組全局比對(duì)Fig.2 Global comparison of D. huoshanense, D. moniliforme, D. nobile and D.candidum chloroplast genomes

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MAFFT軟件對(duì)從NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的15個(gè)葉綠體基因組完成基因組與鐵皮石斛基因組序列的比對(duì)，再通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，鐵皮石斛與霍山石斛、細(xì)莖石斛、石斛成一簇，其中與石斛親緣性最近(圖3)。

圖3 基于16個(gè)葉綠體基因組構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.3 The evolutionary tree contructed based on 16 chloroplast genomes

3 討 論

鐵皮石斛是珍貴的中藥材，藥用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。鐵皮石斛自然條件下種子與真菌共生才能萌發(fā)，加上近年的過度采挖，導(dǎo)致野生石斛瀕臨滅絕，人工栽培面積逐步擴(kuò)大，為保證種源的品質(zhì)及穩(wěn)定性，已有研究人員通過EST-SSR[25]、ISSR[26]、SRAP[27]、TRAP[28]等分子手段為保證鐵皮石斛的品質(zhì)提供了一定的參考。本研究通過葉綠體基因組的發(fā)育關(guān)系分析鐵皮石斛種間系統(tǒng)親緣關(guān)系，對(duì)上述研究進(jìn)行進(jìn)一步補(bǔ)充。基于Illumina高通量測(cè)序及生物信息學(xué)方法分析了鐵皮石斛葉綠體基因組全基因，研究結(jié)果顯示，與大多數(shù)被子植物類似，為雙鏈環(huán)狀的四分體結(jié)構(gòu)，大小為153 508 bp，共編碼133個(gè)基因(93個(gè)CDS基因，32個(gè)tRNA基因以及8個(gè)rRNA基因)，其結(jié)果符合被子植物葉綠體規(guī)律，編碼基因約為130個(gè)[9]。GC的含量占總堿基數(shù)量的37.51%，與劉潮等[29]研究結(jié)果一致，葉綠體基因組的GC含量區(qū)間為31.0%～38.0%，在LSC區(qū)域?qū)?yīng)的百分比為35.13%，SSC區(qū)域?qū)?yīng)的百分比為30.24%、IRa區(qū)域?qū)?yīng)的百分比為43.35%和IRb區(qū)域?qū)?yīng)的百分比為43.35%，其中IRs區(qū)GC含量最高，具體表現(xiàn)為：IRs區(qū)>LSC區(qū)>SSC區(qū)，源于該區(qū)域rRNA基因所含的GC含量高，可能與其區(qū)域含有NADH基因有關(guān)[30]。

葉綠體遺傳多樣性分析對(duì)種質(zhì)資源的收集具有一定的意義。葉綠體基因組中存在的長(zhǎng)重復(fù)序列及簡(jiǎn)單重復(fù)序列在序列變異中發(fā)揮著重要的作用[31]，且因其SSR含量極其豐富、分布隨機(jī)、多態(tài)性高，為母系遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于分子標(biāo)記[32]，被用于物種遺傳多樣性，基因組圖譜等的研究[33]。本研究利用在線軟件分析，獲得長(zhǎng)重復(fù)序列47個(gè)(正向重復(fù)序列為19個(gè)，反向重復(fù)序列為20個(gè)，互補(bǔ)重復(fù)序列為8個(gè))，其結(jié)果與細(xì)莖石斛[34]相一致，與石豆蘭屬結(jié)果[35]不一致，說明植株的親緣性與重復(fù)序列的數(shù)量和類型存在一定的關(guān)聯(lián)性。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)63個(gè)(單核重復(fù)序列36個(gè)，二核苷酸重復(fù)序列15個(gè)，三核苷酸重復(fù)序列5個(gè)，四核苷酸重復(fù)序列5個(gè)，五核苷酸重復(fù)序列1個(gè)、六核苷酸重復(fù)序1個(gè))，葉綠體基因組中SSR以單核重復(fù)序列和二核重復(fù)序列較多，且A/T堿基含量較高，其中單核重復(fù)序列以多聚A和多聚T重復(fù)類型較多，多聚G和多聚C重復(fù)類型較少，其符合植物葉綠體基因組SSR序列組成的規(guī)律，該研究結(jié)果與其他物種相一致[36]。所獲得的重復(fù)序列為鐵皮石斛遺傳多樣性研究提供了可選用的分子標(biāo)記。

近年來，對(duì)石斛屬植物利用了多種技術(shù)，包括EST-SSR[25]、ISSR[26]、SRAP[27]、TRAP[28]等，做了多項(xiàng)物種多樣性和種間多樣性的研究，但種間關(guān)系仍存在一定疑慮，基于葉綠體基因組的遺傳多樣性分析以及系統(tǒng)進(jìn)化分析能夠在此基礎(chǔ)上提供更有利的證據(jù)。本研究NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了13個(gè)已發(fā)表的蘭科葉綠體基因組，2個(gè)百合科植物(外類群)，通過MAFF軟件進(jìn)行序列的比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定鐵皮石斛與其他蘭科植物之間的親緣關(guān)系。結(jié)果顯示，鐵皮石斛與霍山石斛、細(xì)莖石斛、石斛成一簇，其中與石斛親緣性最近。本研究結(jié)果為我國(guó)鐵皮石斛植物資源的保護(hù)和遺傳育種提供了一定的理論依據(jù)。