溫霓婷 周 杉 楊曉穎 楊麗琦 雷 霆

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 成都 611130）

0 引言

岷江藍(lán)雪花（Stapf）為白花丹科（Plumbaginaceae）藍(lán)雪花屬（Bunge）藥用觀賞植物，花為少見(jiàn)藍(lán)紫色，花期長(zhǎng)（5—10月，部分地區(qū)為4—11月），生命力旺盛，適應(yīng)性強(qiáng)，耐病蟲(chóng)害、耐寒，開(kāi)發(fā)利用前景廣闊。其藥用和康養(yǎng)價(jià)值不可小覷。岷江藍(lán)雪花作為一種藥用植物，有治療風(fēng)濕病、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、氣管炎和一定的鎮(zhèn)痛抗炎等作用；現(xiàn)代藥理學(xué)證明，從其根部提取的白花丹醌等具有鎮(zhèn)痛消炎、抗癌、抑菌等功效。目前，除個(gè)別科研院所將其作為種質(zhì)資源收集栽培外，該植物在我國(guó)幾乎處于野生狀態(tài)，因此，開(kāi)展岷江藍(lán)雪花新材料研究，對(duì)其商業(yè)化開(kāi)發(fā)具有重要的意義。

甲基磺酸乙酯（Ethyl Methane Sulfonate，EMS）是一種應(yīng)用廣泛的化學(xué)誘變劑，可改變DNA的某些結(jié)構(gòu)，用其進(jìn)行誘變育種具有簡(jiǎn)便易行、多效性、誘變范圍廣及突變頻率高等優(yōu)點(diǎn)。在作物育種研究中，EMS發(fā)揮了十分重要的作用，現(xiàn)已應(yīng)用于植物、動(dòng)物、真菌新材料研究領(lǐng)域，如應(yīng)用于藍(lán)花丹、小麥、水稻、沙棗、油莎豆、花生、蕓豆和白樺等植物新種質(zhì)研究，同時(shí)在草魚(yú)、啤酒酵母菌、煙酰胺生產(chǎn)菌等動(dòng)物和微生物誘變上也有一定的應(yīng)用。誘變后的植物在根長(zhǎng)、株高、花色、葉形等方面發(fā)生了突變，出現(xiàn)根長(zhǎng)縮短、植株矮化、花色變淺、葉片狹長(zhǎng)等現(xiàn)象；菌類(lèi)和動(dòng)物誘變后出現(xiàn)發(fā)酵特性變好、酶活性提高現(xiàn)象；草魚(yú)吻端組織細(xì)胞誘變后具有分裂增殖能力。

該項(xiàng)目以岷江藍(lán)雪花種子為試驗(yàn)材料，以EMS為化學(xué)試劑，通過(guò)設(shè)置誘變劑不同濃度與處理時(shí)間，探索適于岷江藍(lán)雪花的EMS誘變劑量，進(jìn)一步研究岷江藍(lán)雪花新種質(zhì)，以獲得新材料，豐富園林花卉資源。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2020年采集于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地（成都市崇州市隆興鎮(zhèn)）的岷江藍(lán)雪花種子。母株均為2年生實(shí)生苗，在盛花期6—10月人工隨機(jī)異株授粉，12月底采收種子，清除雜物后將種子放入干燥器保存，次年6月用于此次研究。甲基磺酸乙酯（EMS）購(gòu)于北京博奧拓達(dá)公司，用75%乙醇溶解EMS（體積比1∶1）后，加入pH值為7.2～7.4的 0.01 mol/L磷酸緩沖液（PBS）定容，配制成2%EMS母液，再按比例稀釋配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的EMS溶液備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理。種子經(jīng)75%酒精滅菌0.5 min，用0.1%升汞滅菌8 min，用去離子水（RO水）沖洗后浸泡24 h，挑選吸脹飽滿(mǎn)、完整的種子用于后續(xù)試驗(yàn)。采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將預(yù)處理好的種子放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的EMS溶液中，RO水處理設(shè)為CK，pH值為7.2～7.4的0.01 mol/LPBS（含乙醇）處理組設(shè)為CK，恒溫培養(yǎng)1 、3 、5 、7 h，共24個(gè)處理組合，每組60粒種子。處理完成后，用5%硫代硫酸鈉解毒30 min，再以流水沖洗2 h。將沖洗后的種子均勻地鋪在墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，放入20～25 ℃培養(yǎng)箱中待種子發(fā)芽。將發(fā)芽種子移栽于泥炭土和珍珠巖配比為3∶1的穴盤(pán)中，置于20～25 ℃、光照 140 μmol/(m·s)、濕度80%培養(yǎng)箱中。待長(zhǎng)出真葉后移栽至15 cm雙色盆中，并放入苗圃統(tǒng)一管理。

1.2.2 種子發(fā)芽率與幼苗形態(tài)測(cè)定。

岷江藍(lán)雪花種子播后90 d，用游標(biāo)卡尺測(cè)量幼苗株高、冠幅，株高每株測(cè)定3次，冠幅分東西測(cè)量和南北測(cè)量，每個(gè)方向各3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS劑量效應(yīng)方差分析

由表1、2、3可知，EMS濃度、浸種時(shí)間對(duì)各處理種子萌發(fā)率、株高及冠幅的影響是極顯著的，致死和不同程度植株小型化是由EMS的劑量變化造成的。濃度與浸種時(shí)間存在顯著的交互作用，可以進(jìn)一步進(jìn)行處理組之間的多重比較。

表1 萌發(fā)率方差分析表

表2 株高方差分析表

表3 冠幅方差分析表

2.2 EMS處理對(duì)岷江藍(lán)雪花種子發(fā)芽率的影響

由圖1可知，與對(duì)照（CK、CK）相比，EMS抑制了種子萌發(fā)。處理時(shí)間7 h，EMS濃度為1.0%，發(fā)芽率約89.00%；濃度增加至1.5%，發(fā)芽率急劇下降至33.33%，濃度繼續(xù)增加至2.0%，發(fā)芽率繼續(xù)減少約5.00%，兩濃度之間無(wú)顯著差異。處理時(shí)間為 5 h，1.5%濃度發(fā)芽率較1.0%顯著下降，2.0%濃度時(shí)發(fā)芽率急劇降低至34.00%，此濃度下處理5 h與 7 h之間差異不顯著。CK是RO水浸種，平均發(fā)芽率為92.76%，CK是EMS溶液的溶劑浸種，發(fā)芽率為93.96%，二者幾乎沒(méi)有差異。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，CK組內(nèi)岷江藍(lán)雪花種子發(fā)芽率變化與處理時(shí)間沒(méi)有規(guī)律，表明磷酸緩沖液作為溶劑對(duì)種子萌發(fā)有干擾，但對(duì)于岷江藍(lán)雪花種子發(fā)芽率下降沒(méi)有作用，各EMS處理組中種子萌發(fā)率下降主要是溶質(zhì)EMS產(chǎn)生的效應(yīng)。

圖1 不同濃度EMS與浸種時(shí)間處理對(duì)岷江藍(lán)雪花種子發(fā)芽率的影響

2.3 EMS處理對(duì)幼苗株高的影響

由圖2可知，與對(duì)照CK平均株高231.67 mm相比，經(jīng)EMS處理的幼苗明顯矮化；但CK的株高小于低劑量EMS處理的植株。隨著EMS劑量（濃度與時(shí)間）增加，植株矮化越發(fā)明顯。相同的處理時(shí)間下，EMS濃度越高，植株平均高度越低。2.0%濃度處理超過(guò)1 h，1.5%濃度處理超過(guò)3 h，種子雖然能萌發(fā)，但后期逐漸死亡，無(wú)法成苗。與CK相比，2.0%EMS處理1 h植株平均高度下降超過(guò)30%，0.5%和1.0%濃度處理7 h平均株高下降約50%，1.5%濃度處理3 h平均株高下降至（81.40± 8.47） mm，僅為CK株高的35%，這些差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。

圖2 不同濃度EMS與浸種時(shí)間處理下岷江藍(lán)雪花株高

2.4 EMS處理對(duì)幼苗冠幅的影響

由圖3可知，與對(duì)照CK平均冠幅149.70 mm相比，EMS處理的幼苗冠幅縮小10%～60%；CK的冠幅小于CK及低劑量EMS處理的植株。EMS劑量（濃度與時(shí)間）增加，冠幅縮減；2.0%濃度處理超過(guò)1 h，1.5%濃度處理超過(guò)3 h，種子雖然能萌發(fā)，但后期逐漸死亡，無(wú)法成苗。與CK相比，2.0%EMS處理1 h植株平均冠幅下降32%，0.5%和1.0%濃度處理7 h平均冠幅下降約45%，1.5%處理3 h的平均冠幅最小，僅為CK冠幅的42%，均達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著差異（＜0.05）。

圖3 不同濃度EMS與浸種時(shí)間處理下岷江藍(lán)雪花冠幅

3 結(jié)論與討論

研究設(shè)置不同EMS濃度與處理時(shí)間，對(duì)岷江藍(lán)雪花種子進(jìn)行化學(xué)誘變處理。學(xué)界通常認(rèn)為，半致死劑量可以取得存活率與誘變率的平衡。此次研究以發(fā)芽率作為判斷半致死劑量的指標(biāo)，1.5%EMS處理大于 5 h小于7 h、2.0%EMS處理超過(guò)3 h小于5 h，可能是半致死劑量，但需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)更細(xì)致的試驗(yàn)予以證明。EMS處理通常會(huì)引起供試材料小型化，在外觀上表現(xiàn)為株高變矮、冠幅變小、根系縮短等，這為突變體的初步篩選、減少鑒定工作量提供了便利，便于早期挑選潛在的變異植株。在此次研究中，EMS處理后植株高度和冠幅下降最大幅度達(dá)到65%和55%，2.0%EMS處理1 h、0.5%和1.0%濃度處理7 h以及1.5%濃度處理3 h，與半致死劑量基本重合，由此獲得的植株小型化最為顯著，是進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)突變體的重點(diǎn)群體。半致死劑量可能是岷江藍(lán)雪花種子的最佳誘變條件，為岷江藍(lán)雪花進(jìn)一步構(gòu)建突變體庫(kù)奠定了基礎(chǔ)。

雖然研究觀察到了M代植株顯著的形態(tài)變化，但是否為可遺傳的穩(wěn)定變異尚未可知，需要通過(guò)自交獲得穩(wěn)定的遺傳群體，其中M代為關(guān)鍵選育期，但岷江藍(lán)雪花具有自交不親和特性，自交結(jié)實(shí)率較低，為后代的鑒定帶來(lái)巨大的障礙。因此，可以將M代進(jìn)行組織培養(yǎng)，繼代3～5代后，對(duì)仍表現(xiàn)出小型化的植株通過(guò)分子標(biāo)記或全基因組重測(cè)序。將誘變育種與組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，既克服了岷江藍(lán)雪花自交不親和的障礙，也解決了木本植物獲得穩(wěn)定遺傳時(shí)間較草本植物更長(zhǎng)的難題。