張婷，楊永恒，孫玉明，徐曉洋，王銀杰，張永俠，原海燕

（江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所/南京中山植物園，南京 210014）

0 引言

菊科多年生草本植物甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）是一種新興保健型糖料作物，原產(chǎn)于南美巴拉圭和巴西交界的阿曼拜山脈，在當(dāng)?shù)匾延袛?shù)百年的食用歷史。其葉片中富含的甜菊糖苷是一類四環(huán)二萜類物質(zhì)，因具有高甜度（約為蔗糖的300～400 倍）、低熱量（約為蔗糖的1/300）、預(yù)防和輔助治療高血壓、糖尿病和腫瘤等疾病的功效而被廣泛應(yīng)用于食品、飲料和醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-2]。自1976 年首次從日本引種種植成功以來(lái)，目前我國(guó)已成為世界甜葉菊種植與原料生產(chǎn)和出口最大的國(guó)家，其中甘肅、新疆和內(nèi)蒙古等省區(qū)則因?yàn)槠淙照蛰^長(zhǎng)、病蟲害發(fā)生較輕等獨(dú)特的區(qū)位優(yōu)勢(shì)已逐漸發(fā)展成為甜葉菊的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)[3]。然而，這些區(qū)域氣候干燥且降水量少，而甜葉菊屬淺根系植物、喜濕不耐旱[2]，因此提高其耐旱性對(duì)于降低甜葉菊原料生產(chǎn)成本及節(jié)約水資源都具有重要意義。

AP2/ERF 類蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，它們均包含由大約60 個(gè)氨基酸組成的AP2 保守結(jié)構(gòu)域。該家族可進(jìn)一步被分為AP2、ERF、RAV、DREB 和Soloist 五個(gè)亞家族[4]，其中DREB 亞家族又進(jìn)一步被分為A-1～A-6亞組，A-1亞組蛋白主要參與植物冷脅迫響應(yīng)，而A-2 亞組蛋白則在抗旱及耐熱方面起重要作用[5]，這兩個(gè)亞組蛋白均可結(jié)合含有DRE/CRT 元件基序從而啟動(dòng)下游基因表達(dá)[6]。擬南芥中A-2 亞組包含8 個(gè)DREBs，其中只有DREB2A和DREB2B能夠被干旱脅迫顯著誘導(dǎo)表達(dá)，表明這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能在該亞組中起主要作用[7]。對(duì)AtDREB2A 蛋白激活活性研究發(fā)現(xiàn)其靠近AP2 結(jié)構(gòu)域的部位存在一段負(fù)調(diào)控區(qū)域，去除這段序列（AtDREB2A CA）可以顯著提高AtDREB2A的轉(zhuǎn)錄激活活性。過表達(dá)AtDREB2A CA可以明顯增強(qiáng)植株的耐旱性，而過表達(dá)AtDREB2A基因全長(zhǎng)則不能，表明AtDREB2A可能存在轉(zhuǎn)錄后修飾[8]。除了At-DREB2A，過表達(dá)水稻、玉米和蘋果等的DREB2A同源基因均可提高植株的耐旱性[9-11]，表明DREB2A在不同物種中的功能具有保守性。

本研究通過同源克隆的方法在甜葉菊中克隆擬南芥AtDREB2A的同源基因，對(duì)其組織表達(dá)及水分脅迫響應(yīng)模式進(jìn)行分析，并進(jìn)一步明確其亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性。以上研究為后續(xù)進(jìn)一步明確SrDREB2A的分子功能及通過轉(zhuǎn)基因手段提高甜葉菊的耐旱性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與種植條件

本試驗(yàn)采用的甜葉菊品種為‘中山6 號(hào)’，保存于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所甜葉菊種質(zhì)資源圃。取生長(zhǎng)一致的甜葉菊插穗扦插于營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1的基質(zhì)中，待生長(zhǎng)至6片左右完全展開葉后取出植株并將根部洗凈。自然失水脅迫處理方法參照張常青等的菊花耐旱性評(píng)價(jià)方法[12]并略作改動(dòng)，其中脅迫時(shí)間點(diǎn)取0、1、4、8 h。用于亞細(xì)胞定位試驗(yàn)的煙草種植于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=2∶1，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度80～100μmol/(m2·s)，光周期為16 h光照/8 h黑暗，進(jìn)行正常的水分管理。

1.2 試驗(yàn)方法

取‘中山6 號(hào)’根、節(jié)、節(jié)間、葉以及自然失水脅迫試驗(yàn)的甜葉菊葉片于液氮中速凍，然后于-80 ℃保存。利用Trizol 試劑（TAKARA）提取總RNA，之后根據(jù)PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit（TAKARA,D6110A）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。通過擬南芥AtDREB2A（NCBI 登錄號(hào)：AED90871）的序列信息，在本課題組甜葉菊轉(zhuǎn)錄組庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，并利用NCBI在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)引物SrDREB2A-F/R（引物序列見表1）進(jìn)行同源基因克隆。利用Pfu 高保真酶（TAKARA）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt（全式金）載體上后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α細(xì)胞并涂布于含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取生長(zhǎng)出的單克隆菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并選取含有目的條帶的菌液委托測(cè)序公司（通用生物）進(jìn)行測(cè)序進(jìn)而得到目的基因序列。

表1 研究所用的PCR 引物Table 1 PCR primers used in this study

1.2.2 qRT-PCR分析

利用SYBR Premix Ex Taq 試劑（TAKARA）在CFX96 定量PCR 儀（BIO-RAD 公司）對(duì)SrDREB2A在不同組織及不同失水脅迫時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行定量分析，內(nèi)參選擇β-Actin（AF548026），并利用2-ΔΔCt方法計(jì)算SrDREB2A的相對(duì)表達(dá)量[13]。定量引物見表1。

1.2.3 進(jìn)化樹構(gòu)建及結(jié)構(gòu)域分析

在NCBI網(wǎng)站通過在線BLAST序列比對(duì)，下載不同物種中DREB 亞家族蛋白序列，并利用MEGA 5.0軟件對(duì)所有序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，選擇Neighbor-joining 方法，Bootstrap 參數(shù)值設(shè)為1 000。另外將SrDREB2A 蛋白序列提交NCBI進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，利用DNAMAN 軟件將SrDREB2A 及其同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)并標(biāo)注結(jié)構(gòu)域所在位置。

1.2.4 亞細(xì)胞定位

利用SrDREB2A-GFP-F/R 引物（序列見表1）對(duì)SrDREB2A全長(zhǎng)序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用ClonExpress?II One Step Cloning Kit試劑盒（諾唯贊公司）并通過同源重組方法插入到pCAMBIA1305-GFP空載的GFP基因序列上游。GFP空載及SrDREB2A-GFP載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法注射進(jìn)生長(zhǎng)5周左右的健康煙草葉片中。對(duì)煙草進(jìn)行正常管理，2 d后利用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5）觀察綠色熒光的定位情況。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄激活活性分析

粗糙集理論作為一種新型的信息處理數(shù)學(xué)工具，主要應(yīng)用于已知信息不精確、不完備、不統(tǒng)一等場(chǎng)合?？茖W(xué)合理地將灰色系統(tǒng)理論和粗糙集理論進(jìn)行結(jié)合，能更好地解決信息不確定、不完全處理領(lǐng)域的問題。粗糙集理論的重點(diǎn)內(nèi)容是知識(shí)約簡(jiǎn)，即利用已知的決策對(duì)象、決策指標(biāo)、灰色聚類結(jié)果形成一個(gè)原始決策表，考慮到元?jiǎng)幼鲉卧收夏Ｊ降囊阎獢?shù)據(jù)存在不完全性并且聚類結(jié)果存在灰性(即信息不精確)的特點(diǎn)，若直接對(duì)所建立的原始決策表進(jìn)行知識(shí)約簡(jiǎn)，那么很可能會(huì)導(dǎo)致極小決策算法與問題的實(shí)際意義相悖。為了優(yōu)化決策算法，使決策規(guī)則更具柔性，筆者先對(duì)原始決策表進(jìn)行離散化處理，然后對(duì)它進(jìn)行知識(shí)約簡(jiǎn)。

選擇合適的帶酶切位點(diǎn)的引物（引物序列見表1）對(duì)構(gòu)建在pEASY-Blunt 載體上的SrDREB2A序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到SrDREB2A全長(zhǎng)片段，然后利用膠回收試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收，并通過同源重組的方法構(gòu)建在pGBKT7 載體上。利用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（Clontech）將pGBKT7 空載及目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109，然后涂布于SD/-Trp 營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基。30 ℃倒置培養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)選取3 個(gè)克隆分別用無(wú)菌ddH2O 重懸，點(diǎn)至SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+x-α-gal培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。

分別隨機(jī)取3 個(gè)轉(zhuǎn)化進(jìn)pGBKT7-SrDREB2A、pGBKT7 空載的酵母單克隆用2 mL無(wú)菌ddH2O 重懸，點(diǎn)至SD/-Trp/-His及SD/-Trp/-His含不同濃度3AT 的培養(yǎng)基上（3AT濃度設(shè)置為0、10、20、30、40、50、75、100 mmol/L），倒置培養(yǎng)3～5 d后觀察酵母生長(zhǎng)情況。

根據(jù)結(jié)構(gòu)域?qū)rDREB2A基因序列截?cái)喑刹煌L(zhǎng)度，并通過同源重組方式分別構(gòu)建在pGBKT7 載體上。構(gòu)建成功的載體質(zhì)粒及pGBKT7 空載轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109，并涂布于SD/-Trp 培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d。挑取單克隆于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后利用CPRG作為反應(yīng)底物測(cè)定其β-gal活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用EXCEL 2010軟件進(jìn)行處理，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SrDREB2A基因克隆與結(jié)構(gòu)域分析

通過同源克隆的方法我們從甜葉菊中獲得了SrDREB2A的全長(zhǎng)序列并提交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列登錄（登錄號(hào)：MK163642）。該基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為903 bp，編碼301個(gè)氨基酸殘基，通過BioXM 軟件預(yù)測(cè)的蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為33.12 kDa 和5.15，具有一個(gè)典型的AP2 結(jié)構(gòu)域（圖1A）。進(jìn)化樹分析表明，SrDREB2A 屬于DREB亞家族的A-2亞組，與青蒿AaDREB2蛋白親緣關(guān)系最近（圖1B）。

圖1 SrDREB2A序列及進(jìn)化分析Fig.1 Sequence and phylogenetic analysis of SrDREB2A

2.2 SrDREB2A表達(dá)模式分析

對(duì)甜葉菊根、節(jié)、節(jié)間和葉片組織定量分析發(fā)現(xiàn)，SrDREB2A在葉片和節(jié)中的含量較高（圖2A），其中葉片中最高，約為節(jié)間和根中表達(dá)量的2 倍。甜葉菊葉片為其收獲器官并且相對(duì)于其它組織對(duì)水分脅迫更為敏感，另外由于SrDREB2A在葉片中表達(dá)量更高，所以我們更關(guān)注其在葉片中的功能。自然失水脅迫試驗(yàn)表明，葉片中的SrDREB2A表達(dá)水平隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而急劇升高（圖2B），其中脅迫8 h 升高尤為顯著，分別為脅迫0、1、4 h的184、158和18倍，表明葉片中SrDREB2A受水分脅迫顯著誘導(dǎo)表達(dá)。

圖2 SrDREB2A表達(dá)模式分析Fig.2 The expression pattern of SrDREB2A

2.3 SrDREB2A亞細(xì)胞定位

轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)核對(duì)于其行使功能至關(guān)重要。煙草亞細(xì)胞定位試驗(yàn)結(jié)果顯示，空載體GFP分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，而SrDREB2A-GFP 的綠色熒光信號(hào)主要集中在細(xì)胞核中（圖3），表明SrDREB2A 為細(xì)胞核定位蛋白，與其轉(zhuǎn)錄因子功能相吻合。

圖3 SrDREB2A煙草表皮細(xì)胞中亞細(xì)胞定位分析Fig.3 Subcellular localization analysis of SrDREB2A in N.benthamiana epidermal cells

2.4 SrDREB2A轉(zhuǎn)錄激活活性分析

3 次重復(fù)試驗(yàn)均顯示轉(zhuǎn)化進(jìn)pGBKT7 空載的酵母能在SD/-Trp 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但并不能在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade及SD/-Trp/-His/-Ade+x-α-gal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。而轉(zhuǎn)化進(jìn)SrDREB2A 的酵母細(xì)胞均能夠在4種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且能在SD/-Trp/-His/-Ade+x-α-gal培養(yǎng)基上顯色（圖4），表明SrDREB2A 具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖4 SrDREB2A轉(zhuǎn)錄激活活性分析Fig.4 The transactivation activity of SrDREB2A

為了進(jìn)行后續(xù)的酵母雙雜交篩選試驗(yàn)，對(duì)抑制SrDREB2A 激活活性的3AT 濃度進(jìn)行了篩選。3 次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)較高濃度（100 mmol/L）3AT 并不能夠抑制轉(zhuǎn)化進(jìn)SrDREB2A酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖5），表明SrDREB2A具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖5 3AT抑制SrDREB2A轉(zhuǎn)錄激活活性分析Fig.5 Analysis of 3AT inhibiting SrDREB2A transactivation activity

根據(jù)SrDREB2A 蛋白結(jié)構(gòu)域所在位置對(duì)其進(jìn)行分段并構(gòu)建BD 載體。將不同載體轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞并對(duì)其β-gal 活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明SrDREB2A 的轉(zhuǎn)錄激活活性區(qū)段位于R（211～301 aa）段，并且缺失149～179 aa 區(qū)段并不影響SrDREB2A 的激活活性，而此區(qū)段據(jù)報(bào)道對(duì)擬南芥同源蛋白的活性具有抑制作用。此外，F(xiàn)（1～210 aa）段不具有轉(zhuǎn)錄激活活性（圖6），因此可用于后續(xù)的酵母雙雜交篩選，以便對(duì)其功能進(jìn)行深入的研究。

圖6 SrDREB2A全長(zhǎng)及不同區(qū)段β-gal活性測(cè)定Fig.6 The β-gal activity of full length and different truncated version of SrDREB2A

3 討論

目前關(guān)于甜葉菊耐旱方面的研究多集中于干旱條件下生理指標(biāo)的變化及根據(jù)相關(guān)生理指標(biāo)對(duì)甜葉菊不同品種耐旱性進(jìn)行評(píng)價(jià)等方面。例如，任廣喜等[14]通過終止灌溉5、10和15 d使甜葉菊植株處于不同干旱脅迫狀態(tài)，然后測(cè)定5 份甜葉菊種質(zhì)材料中的可溶性蛋白、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性及單株干葉產(chǎn)量等，從而對(duì)耐旱性強(qiáng)弱進(jìn)行評(píng)價(jià)。SRIVASTAVA 等[15]通過對(duì)盆栽甜葉菊供給不同水平水分來(lái)研究在水分脅迫條件下甜葉菊的形態(tài)、生理指標(biāo)變化及甜葉菊對(duì)水分脅迫的耐受性。研究發(fā)現(xiàn)水分脅迫下甜葉菊葉片電導(dǎo)率水平急劇增加，株高和葉面積都顯著降低，抗氧化酶活性在輕度水分脅迫下有所提升而在重度干旱脅迫下降低。以上結(jié)果表明甜葉菊對(duì)水分脅迫十分敏感，因此在實(shí)際栽培過程中要保持合適的水分管理[16]。外源物質(zhì)添加在緩解干旱脅迫方面已有較多報(bào)道，在甜葉菊中PRADHAN[17]發(fā)現(xiàn)一氧化氮和腐胺單獨(dú)或聯(lián)合施用可以降低干旱脅迫對(duì)甜葉菊試管苗的傷害。以上研究都較為淺顯，而甜葉菊耐旱基因的挖掘及基于耐旱基因的分子育種方面的研究則尚未報(bào)道。

AP2/ERF 類轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫抗性等多個(gè)方面，本項(xiàng)目組前期克隆了該家族中與甜葉菊耐寒性相關(guān)的SrDREB1A1和SrDREB1A2及調(diào)控根發(fā)育的SrERF5基因[3,18]。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過分子生物學(xué)手段同源克隆了甜葉菊中的SrDREB2A基因，水分脅迫可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，暗示其很可能正向調(diào)控甜葉菊的耐旱性。轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)表明，SrDREB2A 的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)段位于該蛋白C端，與擬南芥中AtDREB2A相類似，但去除在擬南芥中被證實(shí)具有抑制調(diào)節(jié)功能的149～179 aa區(qū)段[8]，并沒有使其轉(zhuǎn)錄激活活性提高，表明甜葉菊中SrDREB2A 可能存在一定的功能分化。在不參與逆境脅迫的情況下，過表達(dá)AtDREB2A 并不能誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)，因此推測(cè)在非逆境脅迫情況下AtDREB2A 處于一種非激活狀態(tài)，而逆境脅迫通過翻譯后修飾從而使AtDREB2A 得以激活下游基因的表達(dá)。其中磷酸化被認(rèn)為是一種很可能存在的修飾模式[19-20]，此外AtDREB2A還存在泛素化修飾狀態(tài)，相關(guān)的互作蛋白DRIP1、DRIP2、BPM等相繼被克隆[21-22]。酵母雙雜交手段被認(rèn)為是尋找目的蛋白的互作蛋白，從而進(jìn)一步闡釋其功能的一種重要手段，而前期明確目的蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性是進(jìn)行此項(xiàng)試驗(yàn)的基礎(chǔ)保證。利用序列全長(zhǎng)進(jìn)行酵母篩庫(kù)工作很可能會(huì)比用截?cái)嗟牡鞍椎玫礁嘈畔?，但試?yàn)發(fā)現(xiàn)即使較高濃度的3AT也不能夠抑制SrDREB2A 的轉(zhuǎn)錄激活活性，因此利用全長(zhǎng)進(jìn)行篩庫(kù)并不可行。因此，對(duì)SrDREB2A 序列進(jìn)行截?cái)喾治觯l(fā)現(xiàn)1～210 aa區(qū)段不具有激活活性，為后續(xù)通過酵母雙雜交篩庫(kù)探究SrDREB2A蛋白調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

（1）SrDREB2A屬于DREB亞家族A-2 亞組，具有一個(gè)典型的AP2 結(jié)構(gòu)域。該基因在葉片中表達(dá)量較高并且受水分脅迫顯著誘導(dǎo)，表明SrDREB2A作為提高甜葉菊耐旱性的基因資源并可用于甜葉菊的耐旱育種工作。

（2）SrDREB2A 定位于細(xì)胞核并且具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性，其F（1～210 aa）區(qū)段可用于后續(xù)的酵母雙雜交篩庫(kù)研究。