田家屹，馬 芳，韓玲玉

清華大學藥學院中藥研究院，北京 100084

引 言

鮮地黃是指玄參科地黃(RehmanniaglutinousLilosch)的新鮮塊根，歸心、肝、腎經，有清熱生津、涼血、止血之功[1]。鮮地黃烘焙成生地黃，歸心、肝、腎經，具清熱涼血、養(yǎng)陰生津之功。生地黃經蒸制或酒燉炮制為熟地黃，歸肝、腎經，具有補血滋陰，益精填髓之功。鮮地黃、生地黃和熟地黃性味功效有所不同，其差異的物質基礎尚不明確。研究表明[2]，地黃主要含環(huán)烯醚萜、紫羅蘭酮、苯乙醇苷、三萜、黃酮、糖類、木脂素、酚酸、氨基酸、揮發(fā)油及無機元素等。有研究發(fā)現[3]，鮮地黃加工成生地黃和熟地黃后，活性成分梓醇和毛蕊花糖苷的含量明顯下降。另有研究發(fā)現[4-5]生地黃寡糖中水蘇糖所占比例最高，加工炮制過程中，水蘇糖含量大幅度的下降與糖類的水解有關。中藥是化學成分極復雜的混合物體系，僅一種或若干種活性成分往往不能準確反映中藥的整體療效。雖然有HPLC法建立鮮地黃指紋圖譜[6-7]等研究，但經過提取后往往不能真實全面地表征中藥的化學組成。中藥材及其制劑的整體分析和質量控制是必然的發(fā)展趨勢。紅外光譜作為一種全息指紋圖譜，能夠反映出其中所有成分的綜合信息，具有特征性強、取樣量小、簡單、快速、無損無污染等特點，在中藥成分整體分析方面發(fā)揮著不可替代的作用[8-9]。

李雯霞等[10]使用壓片法對鮮地黃及其炮制品進行了紅外光譜的分析，證明了紅外光譜法在鮮地黃、生地黃和熟地黃差異成分分析應用的可行性。但對鮮地黃進行切片80 ℃減壓干燥24 h的處理方法與實際應用不符。張波泳等[7]直接將鮮地黃冷凍干燥后打粉，凍干粉與生地黃粉末使用ATR和壓片法進行紅外光譜比較，發(fā)現均有一定差異(相關性>0.95)。課題組前期研究發(fā)現，鮮地黃直接打碎后的糊狀樣品及鮮地黃汁與生地黃和熟地黃粉末、煎煮液及冷浸液比較差異更為明顯(相關性均<0.90)。古籍中記載[11-13]，鮮地黃多切片煎煮或絞汁入藥。本研究前期也對加水超聲提取法進行了考察，發(fā)現超聲提取的過程中鮮地黃樣品發(fā)生褐變影響后續(xù)試驗?，F代研究有采用壓榨法[14]對鮮地黃進行提取，但鮮地黃在保存過程中存在失水問題，壓榨法重復性差，難以進行定量研究。為了更好的保證鮮地黃的“鮮”，本研究采用鮮地黃冷凍粉碎的水提物代替鮮地黃汁進行檢測。

研究傅里葉變換衰減全反射紅外光譜儀(attenuated totalinternal reflectance Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR)，并運用紅外光譜法測定鮮、生和熟地黃臨床應用形式的整體成分差異。并運用離子色譜法對差異成分中的單糖和寡糖進行定量分析，研究鮮地黃及其炮制品的整體成分差異，為鮮地黃的研究和應用提供數據支持。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

于河南省焦作市武陟縣北郭鄉(xiāng)南古村收集同批次鮮地黃及生地黃，經中藥世家傳承人皇甫齊偉藥師鑒定為玄參科地黃。D-甘露糖(批號：YR-1805011)，甘露三糖(批號：YR-1802001)，水蘇糖(批號：YR-21193)，果糖(批號：YR-21896)，無水葡萄糖(批號：YR-21882)，半乳糖(批號：YR-21893)，均購自寶雞市翊瑞生物科技有限公司，蜜二糖(批號：S11145)購自上海源葉生物科技有限公司，毛蕊花糖苷(批號：HA141444298)購自晨光生物科技集團股份有限公司，純度均>98%。黃酒為會稽山紹興香雪酒，乙醇(上海泰坦化學有限公司)為分析純，超純水由GenPure Milli-Q超純水系統制備。3k15高速離心機(Sigma)，MM400混合冷凍混合球磨儀(Retsch)，Spectrometer Spectrum two FT-IR紅外光譜儀(PerkinElmer)，ckw1100溫控儀(北京市朝陽自動化儀表廠)，ScientificDionexICS-5000+離子色譜儀(Thermo)，GenPure超純水系統(Thermo)，Qilnbeier6渦旋振蕩器(Scientific Industries)，XS204DR電子天平(Mettler Toledo)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

取鮮地黃5株，清除表面泥土，切塊，采用榨汁機將其打碎成糊狀，置入液氮中速凍成塊狀，液氮環(huán)境下冷凍研磨30 s磨至細粉，-80 ℃冷凍保存，備用，準確稱取每株鮮地黃的冷凍研磨粉末10 g，分別加入100 mL超純水渦旋10 min，離心9 500 r·min-1，10 min，取上清液，作為鮮地黃供試品水溶液。

生地黃分別取5株按2020版《中國藥典》規(guī)范切制飲片，備用。熟地黃參照北京市2008版藥物炮制規(guī)范對生地黃進行炮制，備用。分別準確稱取每株生地黃及熟地黃飲片各10 g置于圓底燒瓶中，加入100 mL的超純水浸泡30 min。100 ℃下水浴鍋加熱回流提取60 min，取出液體，再次加入80 mL超純水加熱回流30 min，倒出液體，合并兩次提取液，紗布過濾，濃縮，超純水定容至100 mL，靜置放冷，離心9 500 r·min-1，10 min，分別取上清液，作為生地黃、熟地黃供試品水溶液。

1.2.2 ATR-FTIR光譜采集

分別取上述鮮地黃、生地黃和熟地黃供試品水溶液2 μL滴于ATR-FTIR的金剛石表面，靜置20 min待樣品揮干且紅外圖譜穩(wěn)定后，在4 000～400 cm-1范圍內采集紅外光譜，分辨率4 cm-1，掃描次數16次，掃描實時扣除CO2和H2O干擾。

用Spectrum軟件(Perkin Elmer)對原始ATR-FTIR紅外光譜進行ATR矯正，讀取峰位置，計算相關系數值。采用13點平滑獲得到二階導數紅外圖譜。

1.2.3 離子色譜測定地黃糖類成分含量

色譜柱：Dionex Carbopac PA20 BloLC 3×150 mm Analytical，保護柱：Dionex Carbopac PA20 BloLC 3×30 mm Guard，進樣量：10 μL，流速：0.4 mL·min-1，淋洗液：A：H2O，B：0.5 mol·L-1氫氧化鈉，C：醋酸鈉200 mmol·L-1，檢測器溫度：30 ℃，柱溫：30 ℃，積分安培檢測器，標準四點位，Au工作電極，梯度洗脫程序見表1，其中40.1～47 min為色譜柱清洗并重新平衡的過程。

表1 梯度洗脫程序

稱取適量對照品，加超純水配置成：甘露糖0.02 mg·mL-1, 甘露三糖0.02 mg·mL-1，水蘇糖0.2 mg·mL-1，果糖0.2 mg·mL-1，葡萄糖0.02 mg·mL-1，半乳糖0.02 mg·mL-1，蜜二糖0.02 mg·mL-1和毛蕊花糖苷0.2 mg·mL-1的混標母液，稀釋至0.5，0.2，0.1，0.05，0.02，0.01倍，4 ℃保存，備用。

分別取鮮地黃、生地黃及熟地黃供試品水溶液80 mL，加20 mL乙醇，4℃冷藏靜置12 h。離心9 500 r，10 min，離心兩次，取上清液，稀釋100倍，作為鮮地黃、生地黃和熟地黃供試品溶液。

分別精密移取供試品溶液及不同濃度對照品各10 μL注入離子色譜，按上述方法進行測定，并計算甘露糖，甘露三糖，水蘇糖，果糖，葡萄糖，半乳糖，蜜二糖，毛蕊花糖苷的含量。

2 結果與討論

2.1 鮮地黃及其炮制品提取物的紅外光譜分析

分別計算鮮地黃、生地黃和熟地黃提取液的ATR平均紅外光譜，結果如圖1所示。表2為三種地黃提取液ATR紅外光譜特征峰位置。與鮮地黃提取液全波段紅外光譜相比，生地黃提取液有17個對應的特征峰，其中有4個特征峰位置相同，相關系數為0.979 7；熟地黃提取液有16個對應的特征峰，沒有相同特征峰位置，相關系數為0.954 3。

圖1 鮮地黃(a)、生地黃(b)和熟地黃(c)提取液的ATR紅外光譜

地黃炮制過程也是糖類分別變化的過程，選取地黃中常見的8種糖類成分：水蘇糖、半乳糖、甘露三糖、果糖、葡萄糖、毛蕊花糖苷、蜜二糖和甘露糖。圖2中列出了這8種糖類標準品的ATR紅外光譜圖。結合圖1和圖2分析，鮮地黃樣品的ATR圖譜中，3 340 cm-1為羥基O—H的伸縮振動吸收峰，隨著地黃的炮制，生地黃的出峰位置在3 326 cm-1，熟地黃的出峰位置在3 307 cm-1，特征峰波數逐漸減少，說明隨著地黃的炮制，樣品含水量逐漸降低，另一方面糖類成分也在轉化為糖苷類；鮮地黃中2 926 cm-1為亞甲基C—H的伸縮振動吸收峰，與甘露三糖特征峰位置相同，生地黃與熟地黃中2 928 cm-1與甘露糖峰位置一致；1 655和1 596 cm-1為O—H彎曲振動吸收峰、芳香環(huán)骨架振動吸收峰及共軛羰基的伸縮振動吸收峰，歸屬于樣品中的水及蛋白類成分；鮮地黃1 236 cm-1為C—H的變形振動吸收峰，明顯區(qū)別于生地黃與熟地黃中特征峰位置1 257 cm-1；1 100～700 cm-1主要是C—O伸縮振動的吸收峰，其主要歸屬于糖類成分。其中鮮地黃提取液和生地黃提取液最高吸收峰位置在1 049 cm-1，而熟地黃提取液最高峰位置為1 029 cm-1，進一步說明地黃炮制過程中糖類發(fā)生轉化。

圖2 糖類標準品的ATR紅外光譜

2.2 鮮地黃及其炮制品提取物的二階導數紅外光譜分析

計算不同地黃提取液樣品與糖類標準品的二階導數圖譜，可以提高譜圖分辨率，增強譜圖特征性，分辨紅外光譜中重疊的吸收峰。圖3為不同地黃樣品在1 200～600 cm-1范圍內的二階導數紅外光譜(second derivative IR, SDIR)，此區(qū)域主要為地黃提取液中端碳基C—H的彎曲振動、糖環(huán)呼吸振動和C—O伸縮振動。如圖3所示，三種地黃提取液的特征峰位置相似，但是相對峰強度不同，且隨著炮制過程呈規(guī)律性變化。鮮地黃中峰1 159和1 141 cm-1隨著炮制過程峰強度逐漸減弱，熟地黃峰位移至1 148 cm-1。鮮地黃中峰1 045 cm-1峰強度逐漸降低，在生地黃中出現新的特征峰1 046 cm-1，逐漸藍移到熟地黃中的1 054 cm-1。同時，峰1 028 cm-1逐漸增強，997 cm-1強度逐漸減弱，并紅移到989 cm-1附近。963 cm-1峰強度逐漸增強伴隨著800 cm-1峰逐漸減弱。鮮地黃中峰789 cm-1也隨著炮制過程逐漸藍移到776 cm-1附近。圖4為8種糖類標準品在1 200～600 cm-1范圍內的SDIR。結合圖4中多種糖類標準品的特征峰位置，可以推測出從鮮地黃炮制到生地黃，最終到熟地黃的過程中，主要是糖類成分組成發(fā)生變化。鮮地黃中多糖發(fā)生水解，生成熟地黃中的寡糖或者單糖。

圖3 鮮地黃(a″)、生地黃(b″)和熟地黃(c″)提取液的二階導數紅外光譜

圖4 糖類標準品的二階導數紅外光譜

圖5 糖類標準品混合溶液的離子色譜

圖6 鮮地黃(a)、生地黃(b)和熟地黃(c)提取液的離子色譜

2.3 鮮地黃及其炮制品提取物離子色譜糖類含量測定

2.3.1 線性關系考察

如表2所示，8種單糖、寡糖及衍生物的線性范圍均R2≥0.999 0，表明在各自線性范圍內線性關系良好。

表2 8種單糖、寡糖成分的線性關系考察

2.3.2 離子色譜測定結果分析

離子色譜法測定8種單糖、寡糖及衍生物結果表見圖7。8種成分除果糖以外，其他均有統計學差異(p<0.05)。歸納總結后發(fā)現：水蘇糖含量在鮮地黃、生地黃和熟地黃水提物中依次降低，而除水蘇糖和果糖外的其他六種糖均是鮮地黃水提物中含量最低。其中，熟地黃水煎液中甘露三糖、毛蕊花糖苷、葡萄糖和蜜二糖含量顯著高于生地黃和鮮地黃，提示它們可能是地黃糖類成分在炮制過程中受熱分解的終產物。

圖7 8種單糖、寡糖及衍生物在鮮地黃、生地黃和熟地黃水提物中含量結果圖(n=5)

Xue[5]等研究認為鮮地黃炮制過程中水蘇糖水解有棉子糖途徑和甘露三糖途徑，其中棉子糖會繼續(xù)水解成蜜二糖，甘露三糖和蜜二糖水解產生半乳糖。其認為甘露糖是多糖水解產物，果糖減少與美拉德反應有關。本研究發(fā)現，生地黃水蘇糖比鮮地黃減少約三分之一，表明大量的水蘇糖同時參與多渠道的水解是鮮地黃在炮制過程中產生的最顯著變化。熟地黃的半乳糖平均值略低于生地黃，表明半乳糖可能在生地黃酒制過程中參與其他反應。而毛蕊花糖苷隨炮制增加與之前研究結論不同，需進一步考證。

3 結 論

采用ATR-FTIR法對鮮地黃水提物、生地黃和熟地黃水煎液進行了整體成分分析，確定糖類為鮮地黃與炮制品最主要的差異成分。進一步，應用離子色譜法對8種單糖及寡糖進行定量分析，證實鮮地黃及其炮制品中糖類成分的差異。研究為鮮地黃的應用和質量控制提供參考。