張 茜，董祥輝，姚衛(wèi)蓉，于 航，謝云飛

江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214000

引 言

氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine，F(xiàn)M)CAS號：42461-84-7，結(jié)構(gòu)式如圖1，是唯一動物專用的非甾體類抗炎藥物(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)，由增溶劑葡甲胺與氟尼辛以1∶1的形式結(jié)合而成。1996年，由Doran等研產(chǎn), 美國SINEBOR公司將其做成商品名為Banamine的注射液, 用于動物疾病治療[1]。2007年6月1日，齊魯動物保健品有限公司獨立研制并申報的FM被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為國家三類新獸藥[2]。

圖1 FM的結(jié)構(gòu)式

FM是一種強(qiáng)效環(huán)氧化酶抑制劑，通過選擇性抑制的環(huán)氧化酶來阻止血栓烷素、前列腺等炎性物質(zhì)的生成，從而起到消炎、解熱、鎮(zhèn)痛的作用。臨床上常用于緩解豬、馬、牛的內(nèi)臟、肌肉、骨骼、乳房、子宮紊亂等引起的炎癥及絞痛，以及傳染病引起的各種急性炎癥的控制、犬內(nèi)毒素血癥的治療等[3]。因其具有給藥量小、吸收迅速、持續(xù)時間長、療效顯著、不良反應(yīng)輕等特點[4]，深受獸醫(yī)青睞，是目前國內(nèi)外獸醫(yī)臨床上消費(fèi)量最大的NSAIDs。近年來，隨著氟尼辛葡甲胺在獸醫(yī)臨床上的廣泛應(yīng)用，其不良反應(yīng)液逐漸凸顯。多表現(xiàn)為胃腸道的毒副作用，如犬、貓的嘔吐、腹瀉和胃腸潰瘍[5]。因此，建立確證有效的檢測方法，對于FM在獸肉中的殘留檢測，至關(guān)重要。

國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中，針對肉類食品中FM或F(氟尼辛)的檢測方法主要有高效液相色譜法[6]、液質(zhì)聯(lián)用法[7]、分光光度法[8]、IC-Elisa法[9]。但這些方法存在設(shè)備昂貴，前處理、檢測操作復(fù)雜，不便攜等缺點，因此極大地限制了其在現(xiàn)場快速檢測中的應(yīng)用。而便攜式拉曼光譜技術(shù)具有便攜、快速、指紋識別等優(yōu)點，能克服上述方法帶來的不便，因而被廣泛用于動物源食品中獸藥殘留檢測。如翟晨等[10]基于SERS技術(shù)，以銀溶膠為增強(qiáng)基底，建立了肝臟與肌肉組織中沙丁胺醇的定量檢測方法，其回收率分別為91.2%和92.1%。Shao等[11]以銀溶膠為增強(qiáng)基底，建立了雞鴨肉中二硝基胺和托曲唑的SERS檢測方法，回收率分別為95.67%，105.39%和94.79%，99.44%，徐寧[12]以金溶膠為增強(qiáng)基底，結(jié)合SERS檢測與主成分分析法，建立了SVM模型，對雞肉中磺胺類藥物進(jìn)行快速檢測。

據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，目前國內(nèi)外均無與FM相關(guān)的SERS檢測方法的報道。因此，本研究以金溶膠作為SERS增強(qiáng)基底，通過優(yōu)化FM的檢測條件與豬肉中FM的提取條件，建立了豬肉中氟尼辛葡甲胺殘留的SERS檢測方法，實現(xiàn)豬肉中FM的快速篩查檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑

氟尼辛葡甲胺(FM，純度99.77%，購于西弗沃實驗室)；氯金酸鉀(純度97.0%)、檸檬酸三鈉二水合物(純度99.0%)購于南京森貝伽生物科技有限公司；提取中所用有機(jī)試劑均為色譜級，無機(jī)試劑均為分析純，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 設(shè)備

便攜式拉曼光譜儀(RamTracer-200-HS，美國歐普圖斯公司)；磁力油浴鍋(ZNCL-S，鞏義市京華儀器有限公司)；超純水制備儀(Direct-Q 5UV，Millipore公司)。

1.3 金溶膠基底的制備

通過檸檬酸鈉(1%)還原氯金酸鉀(10 mg·mL-1)法制備增強(qiáng)基底。實驗所用玻璃器皿、轉(zhuǎn)子均用王水泡12 h，之后用超純水沖洗六次，烘干備用；將油浴鍋升溫至120 ℃；設(shè)置磁力攪拌器參數(shù)為565 r·min-1；在圓底燒瓶中加入47 mL超純水、3 mL氯金酸鉀充分混合，放入120 ℃油浴鍋內(nèi)，同時啟動磁力攪拌器攪拌至沸騰；加入2 mL還原劑，沸騰20 min；冷卻備用，4 ℃存放。

1.4 樣品處理

稱取2.5 g絞碎豬肉于離心管中，加入2 mL 10%(W/V)Na2CO3溶液，渦旋2 min混勻；加入5 mL乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取，渦旋2 min，離心；取上清溶液于另一離心管中，殘渣用5 mL乙酸乙酯重復(fù)萃取一次。將兩次上清液合并，之后于40 ℃氮吹濃縮至5 mL。加入乙腈5 mL、乙腈飽和正己烷7.5 mL除脂質(zhì)。渦旋2 min，離心，盡除去上層液體以及上下層交界處薄薄的一層液體，下層液體轉(zhuǎn)入另一離心管。將下層液體重復(fù)除脂一次。將最終得到的下層清液在45 ℃條件下氮氣吹干，用2 mL甲醇復(fù)溶，用于檢測。離心條件均為10 000 r·min-1、4 ℃和10 min。

1.5 SERS光譜采集

在包覆錫箔紙的玻璃片上，將金溶膠與液體樣品按一定比例混勻。用激發(fā)光源為785 nm的便攜式拉曼光譜儀進(jìn)行掃描，掃描功率150 mW，掃描時間10 s，掃描次數(shù)5次。每一個樣品采集10張光譜圖，做平均拉曼光譜。FM固體樣品光譜采集時，直接將FM粉末放在錫箔紙上進(jìn)行采集，采集條件同液體樣品。

1.6 密度泛函理論計算

為了對FM的拉曼峰進(jìn)行歸屬指認(rèn)，采用密度泛函理論(density functional theory，DFT)，模擬了FM的理論拉曼光譜。操作如下：使用Gauss View 5.0 軟件構(gòu)建FM分子模型；分別對氟尼辛和葡甲胺分子進(jìn)行幾何構(gòu)型優(yōu)化，之后采用同樣的幾何優(yōu)化方法，將已經(jīng)優(yōu)化好的氟尼辛、葡甲胺分子放在一起進(jìn)行幾何優(yōu)化。采用Gaussian 09程序進(jìn)行DFT計算，計算關(guān)鍵字為“freq=raman b3lyp/6-311g(d)”。將理論拉曼光譜圖與固體拉曼光譜圖對比，進(jìn)行峰歸屬指認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 理論計算光譜

圖2(a)為FM在DFT計算中的結(jié)構(gòu)優(yōu)化圖，葡甲胺分子的位置與氟尼辛中羧基位置較為接近。圖2(b)為固體拉曼光譜與理論計算拉曼光譜的比較，理論光譜矯正因子為0.966?？煽蠢碚撚嬎阕V圖與固體拉曼譜圖存在部分偏差，如普通拉曼出峰位置為429 cm-1，而理論計算光譜的出峰位置為397 cm-1。由于實際檢測條件與理論計算中的理想條件有出入，在出峰情況上，二者也存在在一定的差異，如理論計算光譜中824～1 085 cm-1范圍內(nèi)有峰，而固體拉曼光譜中沒有出峰；理論計算光譜在1 597～2 000 cm-1范圍內(nèi)出峰，而固體拉曼圖沒有出峰。理論計算中設(shè)定物質(zhì)處于真空環(huán)境，而實際實驗中FM以粉末存在，有分子間作用力以及外界非真空環(huán)境的影響。

圖2 優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)式(a)，藍(lán)、紅、灰、白、綠球分別為N、O、C、H、F原子；理論計算拉曼光譜與固體拉曼光譜比較(b)

2.2 檢測條件優(yōu)化

對樣品與金膠之間的體積比進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果如圖3(a)所示，隨著金溶膠體積比增大，731 cm-1處的SERS信號先增強(qiáng)后減弱，當(dāng)樣品與金溶膠的體積比為1∶31(V/V)時，SERS增強(qiáng)效果最好。在此過程中，金納米粒子上有限的活性位點與樣品濃度共同影響了SERS強(qiáng)度。1∶3前，活性位點占據(jù)主導(dǎo)影響因素。此時隨著金納米粒子的增多，吸附的樣品分子數(shù)增多，因此SERS信號逐漸增強(qiáng)。1∶3時，活性位點飽和，此時SERS效果最好。1∶3后，金溶膠對FM濃度的稀釋作用逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，因此SERS信號逐漸減弱。

金溶膠中，納米粒子之間的熱點距離對增強(qiáng)待測物信號有很大的影響，合適的聚沉有利于縮短納米粒子之間的熱點距離，提高增強(qiáng)效果。在檸檬酸鈉還原氯金酸鉀制備金溶膠中，過多的檸檬酸根離子充當(dāng)穩(wěn)定劑，包裹在金納米粒子周圍，進(jìn)而防止金納米粒子的過度聚沉，pH的變化與促凝劑的添加都容易破壞該靜電保護(hù)層，從而影響增強(qiáng)效果。

FM甲醇溶液的pH為6.5，在調(diào)pH后，從圖3(b)可以看出，pH在5～6時，731 cm-1處的SERS信號最好，過度調(diào)酸與調(diào)堿都會使拉曼信號減弱。促凝劑的添加，會使納米顆粒聚集，在增加熱點的同時也增加了分析物的吸附，因此能極大地提高SERS增強(qiáng)效果。因此，實驗選取了NaCl，KI，NaBr和MgSO4四種鹽溶液，探究促凝劑對FM的增強(qiáng)效果的影響。實驗結(jié)果如圖3(c)所示，促凝劑加入后，SERS信號并沒有得到增強(qiáng)，反而更弱。出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因是加入促凝劑后，完全破壞了金溶膠靜電平衡，使其聚沉為大顆粒。此時比表面積減小，熱點數(shù)目也減少，所以增強(qiáng)效果反而減弱，甚至消失。

圖3 金膠體積比(a)、樣品pH(b)、促凝劑(c)對FM SERS信號的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的定性定量檢測

根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最終選擇10 μL樣品，30 μL金膠，將待測樣品的pH調(diào)至6，不加任何促凝劑作為制樣條件，功率為150 mW，積分時間10 s，積分次數(shù)5次作為檢測條件。對0.1～1 000 mg·L-1FM甲醇溶液進(jìn)行SERS檢測，測試光譜如圖4所示。

圖4 不同濃度FM甲醇溶液的SERS譜圖

發(fā)現(xiàn)在731，1 085和1 376 cm-1處，當(dāng)濃度低至0.98 mg·L-1時，仍可看見微弱的峰，濃度繼續(xù)低至0.1 mg·L-1時，1 376 cm-1處仍有極其微弱的峰出現(xiàn)，但是731和1 085 cm-1處完全無峰。因此甲醇溶液中FM溶液的檢測限為0.98 mg·L-1。分析了圖中典型峰位731，1 085和1 376 cm-1等處的線性擬合情況，結(jié)果如表2所示，在0.98～125 mg·L-1范圍內(nèi)都具有良好的線性關(guān)系。

表1 各波數(shù)線性擬合

2.4 實際樣品提取方法優(yōu)化

FM易與豬肉基質(zhì)結(jié)合，不利于加標(biāo)后的萃取。因此，為使FM與基質(zhì)分離，使用強(qiáng)酸(6 mol·L-1HCl，90 ℃，2 h)、酶(β-葡萄糖苷酸酶、常溫、5 h)將豬肉水解，再進(jìn)行萃取。結(jié)果如圖5(a)所示，兩組組均沒出現(xiàn)特征峰。強(qiáng)酸水解、酶解使蛋白、脂質(zhì)被分解小分子物質(zhì), 導(dǎo)致萃取后的凈化難度增大，因此在檢測時基質(zhì)干擾極大，無特征峰出現(xiàn)?？紤]到上述情況，嘗試通過調(diào)節(jié)提取環(huán)境酸堿的方式來進(jìn)行萃取前處理。將2 mL 10%Na2CO3與0.1 mol·L-1HCl加入到豬肉中，之后再進(jìn)行萃取。實驗結(jié)果如圖6(a)所示，10% Na2CO3組在731, 1 085和1 376 cm-1處出現(xiàn)特征峰。而0.1 mol·L-1的HCl處理沒有出現(xiàn)特征峰。因此加入10%Na2CO3進(jìn)行萃取前處理方法。

FM易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等溶劑，實驗比較了這幾種常用萃取劑的萃取效果。如圖5(b)所示，使用乙酸乙酯萃取時，基質(zhì)干擾較少，加標(biāo)組(200 mg·L-1FM)在731, 1 085和1 376 cm-1等處出現(xiàn)特征峰。而當(dāng)萃取劑為甲醇、乙醇時，無特征峰出現(xiàn)?？赡茉蚴侨忸愔泻械牡鞍踪|(zhì)會與乙醇、甲醇反應(yīng)產(chǎn)生變性現(xiàn)象，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物的干擾太大，從而無法出特征峰。而選用乙酸乙酯作為萃取劑時，基質(zhì)干擾小。因此，后續(xù)實驗加入10% Na2CO3進(jìn)行萃取前處理，然后再用乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取。

圖5 萃取環(huán)境(a)與萃取劑(b)的影響

2.5 實際樣品的檢測

如圖6(a)所示，確定731, 1 085和1 376 cm-1為其特征峰。選731 cm-1作為定性定量峰，采用空白樣本基質(zhì)液加標(biāo)的方法繪制標(biāo)曲。圖6(b)所示，在1～250 mg·L-1內(nèi)，基質(zhì)加標(biāo)液的濃度與拉曼峰強(qiáng)之間具有良好的線性關(guān)系，其R2為0.99，擬合方程ISERS=49.13XC+3 359.5。通過回收率實驗預(yù)測線性擬合方程的準(zhǔn)確性，對理論濃度分別為200，100和50 mg·L-1的豬肉加標(biāo)液進(jìn)行SERS檢測。其平均回收率在89.61%～95.63%，RSD在1.80%～3.30%，豬肉中的檢測限為1 mg·kg-1。

圖6 實際樣品出峰(a)；731 cm-1處FM濃度與SERS強(qiáng)度之間的線性擬合關(guān)系(b)

3 結(jié) 論

通過對比FM甲醇溶液與甲醇溶液SERS光譜圖，確定了FM的特征峰，并運(yùn)用密度泛函理論計算，對這些峰進(jìn)行歸屬確認(rèn)，其中731 cm-1為吡啶環(huán)、苯環(huán)的面外搖擺，以及C—F搖擺，1 085和1 376 cm-1為苯環(huán)、吡啶環(huán)上C—H搖擺；接著對FM甲醇溶液進(jìn)行了半定量分析，建立了豬肉中FM殘留的SERS檢測方法。其在豬肉中的檢測限為1 mg·kg-1，線性范圍在1～250 mg·L-1，檢測的回收率為89.61%～95.63%，RSD在1.80%～3.30%。本方法快速、穩(wěn)定、結(jié)果確證，適用于現(xiàn)場快速檢測。但其檢測限偏高，不能達(dá)到國家最大殘留限量的靈敏度。因此如何降低其檢測限，值得進(jìn)一步研究。