陳曉燕，錢師宇，曾彩輝，盧建溪

1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物治療中心，廣東 廣州 510000；2.暨南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510000

環(huán)境消毒對于保障藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（good manufactursing practice,GMP）層流實(shí)驗(yàn)室生物安全，保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員健康，保證實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行至關(guān)重要[1]。GMP層流實(shí)驗(yàn)室的核心是安全，采取安全、有效消毒滅菌是實(shí)驗(yàn)室生物安全的重要保障[2]。GMP層流實(shí)驗(yàn)室的空氣質(zhì)量指標(biāo)物主要是塵埃顆粒物（particulate matter,PM）浮游菌，也籠統(tǒng)稱之為微生物氣溶膠。全球超過20%的呼吸道感染是由微生物氣溶膠引起的，微生物氣溶膠能引起呼氣困難、頭暈、頭痛等病癥，對人體健康具有極大影響[3]。此外，進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)的首要條件是無菌環(huán)境，細(xì)胞在體外培養(yǎng)對微生物的防御能力匱乏，極易被污染，為其提供無菌的生存和操作環(huán)境是順利進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的重要保證[4]。消除環(huán)境中的病原微生物、控制室內(nèi)微生物含量非常重要，除了常用化學(xué)消毒液擦拭消毒的表面消毒方法，還有很多空氣消毒方式，如臭氧(O3)、紫外線、二氧化氯、過氧化氫、過濾通風(fēng)、氣體 熏蒸、光催化等，其中臭氧和紫外線消毒應(yīng)用于空氣和表面消毒最為廣泛[5]。本研究利用臭氧聯(lián)合紫外線對GMP層流實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒，并對消毒效果進(jìn)行驗(yàn)證觀察。報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

9 cm血瓊脂平板（江門凱林），紫外線殺菌燈（工作壓力為220 V、功率＞30 W、輻照強(qiáng)度≥70 μW/cm2），臭氧消毒機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 觀察場地 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物治療中心，GMP潔凈實(shí)驗(yàn)室

1.2.2 觀察時間2021年1—12月GMP潔凈實(shí)驗(yàn)室潔凈空調(diào)運(yùn)行期間并臭氧聯(lián)合紫外線消毒，每個月月末布放一次血瓊脂平板做沉降菌檢測；2022年1月暫停潔凈空調(diào)和臭氧聯(lián)合紫外線消毒，更換初、中、高效濾芯兩周后布放一次血瓊脂平板做沉降菌檢測。

1.2.3 消毒 紫外線消毒：2021年1—12月每天兩次（中午12∶00-12∶30和晚上12∶00-12∶30），時長30 min。臭氧消毒：2021年1—12月每周3次（一、三、五晚上12∶00-凌晨1∶30），時長90 min。

1.2.4 采樣 用直徑9 cm血瓊脂平板，在室內(nèi)應(yīng)用自然沉降法進(jìn)行采樣，平板采樣的位置為室內(nèi)距墻1 m處四角，距地面1 m處。本中心GMP潔凈實(shí)驗(yàn)室分為正壓潔凈室和負(fù)壓潔凈室，正壓潔凈室共計14個采樣布防點(diǎn)：一更、二更、緩沖室1、緩沖室2、緩沖室3、脫衣室、潔具室1、潔具室2、細(xì)胞培養(yǎng)室二、細(xì)胞培養(yǎng)室三、暫存室、儲存室、潔凈走廊二、潔凈走廊三；負(fù)壓潔凈室共計8個采樣布防點(diǎn)：一更、二更、緩沖室1、緩沖室2、緩沖室3、細(xì)胞培養(yǎng)室一、脫衣室、廢物處理室。其中細(xì)胞培養(yǎng)室因面積較大，需布放5個血平板，室內(nèi)距墻1 m處四角和室內(nèi)正中央。其他室各布放兩個血平板，共采集53份樣品。采樣時將平皿打開扣放在平板旁，暴露5 min，蓋好立即將平板置于37℃保溫箱培養(yǎng)48 h，計數(shù)每平板上菌落數(shù)，≤3 CFU/平板判定合格。

采樣方法和監(jiān)測評價標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1998版藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范。

1.3 統(tǒng)計方法

采用Excel和Prism6對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、整理和繪制。

2 結(jié)果

2021年臭氧聯(lián)合紫外線對GMP層流實(shí)驗(yàn)室連續(xù)消毒運(yùn)行12個月，每個月月末布放一次血瓊脂平板做沉降菌檢測，經(jīng)過12個周期重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示（見表1），布放在負(fù)壓潔凈室的8個采樣點(diǎn)均未檢測到沉降菌落。布放在正壓潔凈室的14個采樣點(diǎn)，在2、8、9、12月個別采樣點(diǎn)可見1～2 CFU/平板。其中2月份，緩沖室2的平均菌落數(shù)為1 CFU/平板；細(xì)胞培養(yǎng)室二的平均菌落數(shù)為0.4 CFU/平板；潔凈走廊二的平均菌落數(shù)為0.4 CFU/平板。而8月份的細(xì)胞培養(yǎng)室二的平均菌落數(shù)為0.2 CFU/平板。9月份二更的平均菌落數(shù)為0.5；緩沖室1 CFU/平板的平均菌落數(shù)為0.5 CFU/平板。12月份的一更的平均菌落為1.5 CFU/平板；緩沖室3的平均菌落數(shù)為1 CFU/平板；脫衣室的平均菌落數(shù)為1 CFU/平板；潔具室2的平均菌落數(shù)為0.5 CFU/平板。可見菌落皆≤3 CFU/平板（見圖1），判定合格，每月采集的53份樣本合格率均為100%。

而2022年1月暫停潔凈空調(diào)和臭氧聯(lián)合紫外線消毒，更換初、中、高效濾芯兩周后布放一次血瓊脂平板做沉降菌檢測，此次布放除了正壓潔凈室的暫存室和潔凈走廊二、負(fù)壓的二更無菌落，其他各采樣點(diǎn)都可見菌落生長。其中，負(fù)壓潔凈室的緩沖室3平均菌落數(shù)為4 CFU/平板，負(fù)壓潔凈室的脫衣室平均菌落數(shù)為3.5 CFU/平板（見表1），可見菌落皆＞3 CFU/平板（見圖1），判定為不合格，此次布放采樣合格率為90%。

圖1 GMP潔凈實(shí)驗(yàn)室各采樣點(diǎn)菌落數(shù)

表1 臭氧聯(lián)合紫外線對GMP潔凈實(shí)驗(yàn)室每個月消毒效果（CFU/平板）

續(xù)表1

3 討論

GMP在國際上已成為藥品生產(chǎn)和質(zhì)量管理的基本準(zhǔn)則，是一套系統(tǒng)的、科學(xué)的管理制度，藥品不僅要符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而且其生產(chǎn)全過程必須符合GMP規(guī)定[6]。GMP規(guī)范定義了ABCD 4個潔凈度等級，對于不同潔凈度等級，要求空氣中含有的懸浮粒子、微生物數(shù)量都是嚴(yán)格規(guī)定不同的上限數(shù)值，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》規(guī)定設(shè)立GMP層流實(shí)驗(yàn)室，屬于A+B級實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境要求B級[7-8]。通過對空調(diào)、送排風(fēng)系統(tǒng)、工作區(qū)與緩沖間的壓差嚴(yán)格要求，以及定時定點(diǎn)進(jìn)行消毒滅菌，保證空氣潔凈度，達(dá)到GMP基本要求[9]。

紫外線是一種低能量電磁輻射，照射菌體后引起原生質(zhì)變化或死亡達(dá)到消毒滅菌的作用[9]，紫外線是臨床常用的綠色、成本低的空氣消毒方法。但紫外線的照射能量僅有5 ev，穿透性差，消毒有死角、殺菌持效短，其效果還受到照射時間、消毒距離、溫度、濕度、燈管清潔等多方面因素的影響，因此其在臨床中的應(yīng)用受到限制[10]。臭氧是一種強(qiáng)氧化劑和催化劑，能氧化分解細(xì)菌內(nèi)部葡萄糖所需的酶，破壞它們的細(xì)胞器和DNA、RNA，破壞細(xì)菌新陳代謝，使細(xì)菌發(fā)生畸變、滅活死亡[10]。其對細(xì)菌繁殖體、病毒、芽孢、真菌等多種微生物，具有較強(qiáng)的除霉、除臭功能，殺菌起效快、持久，殺菌徹底無死角、無殘留污染，同時更廣譜，但臭氧穩(wěn)定性差，具有一定毒性[11]。兩者聯(lián)合使用，既利用紫外線消毒簡便、價格便宜可多次消毒，保證每次實(shí)驗(yàn)后都可以達(dá)到及時消毒滅菌，又利用臭氧廣譜殺菌、殺菌無死角等特點(diǎn)，提高實(shí)驗(yàn)室空氣消毒的效率和質(zhì)量[12]。本研究于2021年1—12月GMP潔凈實(shí)驗(yàn)室潔凈空調(diào)運(yùn)行期間，采用臭氧聯(lián)合紫外線消毒，于每天上、下午實(shí)驗(yàn)結(jié)束，人員離開后于中午和晚上采用紫外線消毒30 min，同時每周3次每兩天晚上臭氧消毒90 min，對GMP層流實(shí)驗(yàn)室空氣和實(shí)驗(yàn)臺面、桌椅、器皿等表面進(jìn)行徹底消毒。消毒效果評價是通過在月末定時定點(diǎn)布放血瓊脂平板進(jìn)行沉降菌檢測驗(yàn)證消毒滅菌效果，結(jié)果顯示，布放在負(fù)壓潔凈室的8個采樣點(diǎn)未見菌落，布放在正壓潔凈室的14個采樣點(diǎn)偶見菌落，但可見菌落皆≤3 CFU/平板，判定合格，合格率均達(dá)到100%，表明臭氧聯(lián)合紫外線消毒可有效滿足消毒要求。2022年1月GMP潔凈實(shí)驗(yàn)室潔凈空調(diào)停止運(yùn)行、消毒，更換初、中、高效過濾器兩周后，布放血瓊脂平板做沉降菌檢測，布放在負(fù)壓潔凈室的2個采樣點(diǎn)可見菌落＞3 CFU/平板。雖然，GMP潔凈實(shí)驗(yàn)室由于更換濾芯和空調(diào)維護(hù)暫停兩周，期間有工人進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，但由于實(shí)驗(yàn)室長期臭氧聯(lián)合紫外線消毒，實(shí)驗(yàn)室仍然相對潔凈，僅有兩個采樣點(diǎn)可見菌落超標(biāo)，此次布放采樣合格率為90%，可見臭氧聯(lián)合紫外線消毒功效的持久性[13]。

綜上所述，臭氧聯(lián)合紫外線消毒，操作簡單，消毒滅菌更徹底，而且避免了因擾動所產(chǎn)生的二次污染，對GMP層流實(shí)驗(yàn)室具有很好的消毒作用，建議在實(shí)驗(yàn)室空氣消毒中廣泛使用。