胡重華，張文平，霍歡歡，安雨琪，黃廣華，梁立文，周磊濤，周秋白

（江西農業(yè)大學 動物科學技術學院/南昌市特色水生生物營養(yǎng)生理與健康養(yǎng)殖重點實驗室，江西 南昌 330045）

【研究意義】維生素A 是一種脂溶性維生素，在動物的細胞分化和增殖、生長、視覺、應激、免疫、生殖、胚胎發(fā)育和健康維持等許多重要的生物過程中發(fā)揮著重要作用[1-3]。水產動物和其他動物一樣，自身不能合成維生素A，需要依賴食物提供維生素A 或其前體—類胡蘿卜素[4]。維生素A 缺乏或過量都會影響魚類的健康及正常生長，導致魚體出現(xiàn)維生素A 缺乏或中毒癥狀。飼料維生素A 缺乏時花鱸（Lateolabrax japonicus）[5]、尼羅羅非魚幼魚（Oreochromis niloticus）[6-7]、草魚（Ctenopharyngodon idella）[8]及比目魚（Hippoglossus hippoglossusL.）[9]表現(xiàn)出生長減緩、死亡率升高、眼球膨脹、鰭基和皮膚充血、鰓蓋扭曲和脊柱歪曲等典型缺乏癥狀。維生素A過量會導致動物死亡率增加、脊椎生長異常和生長減緩等癥狀[7,10]。攝入高維生素A水平飼料時，牙鲆幼魚[11-12]表現(xiàn)出生長受阻、體長變短及骨骼畸形等癥狀，虹鱒[13]、羅非魚[7]和牙鲆[14]的肝臟表現(xiàn)出脆弱和蒼白?！厩叭搜芯俊磕壳埃嘘P魚類對飼料維生素A需求量的報道較多，如吉富羅非魚（Oreochromis nilooticus）需求量2 954.84 IU/kg[15]、青魚幼魚（Mylopharyngodon piceus）需求量2 246.64 IU/kg[16]、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）適宜添加水平為33 705～40 316 IU/kg[17]、武昌魚幼魚（Megalobrama amblycephala）需求量為3 914 IU/kg[18]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）需求量為2 500～3 500 IU/kg[19]。鯉（Cyprinus carpio）需求量在4 000～20 000 IU/kg[20-21]，牙鲆（Paralichthys olivaceus）需求量在10 000 IU/kg以上[22]?！狙芯壳腥朦c】目前，有關黃鱔營養(yǎng)學研究已有較多報道，但主要集中在黃鱔蛋白質及脂肪需求方面[23-29]，有關維生素A的研究未見報道?！緮M解決問題】本試驗以（2.64±0.03）g 人工黃鱔苗為試驗動物，探究飼料中維生素A 對黃鱔生長、血清生化指標及肝臟顯微結構的影響，旨在探究黃鱔對飼料維生素A 的需求，以期為黃鱔人工飼料的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼料

試驗分為7組，每組4個重復，每個重復行50尾。試驗所用黃鱔選自于江西農業(yè)大學水產養(yǎng)殖基地，均為人工繁殖黃鱔苗，平均體質量（2.64±0.03）g，從中篩選1 400尾規(guī)格整齊、體質健康、無病無傷的黃鱔用于試驗。

本試驗采用單因素試驗設計，以魚粉為主要飼料蛋白質源，維生素A 醋酸酯為維生素A 添加源，在7組相同基礎飼料上分別添加維生素A 醋酸酯。添加量設置0～16 000 IU/kg，添加水平分別為：0，500，1 000，2 000，4 000，8 000，16 000 IU/kg（實測值：2 910，3 230，3 520，3840，5 020，7 030，11 800 IU/kg，編號為L1～L7）。試驗所用維生素A醋酸酯（50萬IU/kg）購買于上海麥克林生化科技有限公司。飼料魚粉、豆粕購自江西大佑農生物科技有限公司，玉米蛋白粉及雞肉粉購自浙江湖州海皇生物科技有限公司。所有飼料原料經80 目過篩[30]，按照配比（表1）將各原料充分混勻，加16%的水分后，經40 型單螺桿膨化機在溫度為123～125 ℃下制成粒徑為1.5～2.1 mm 的條狀膨化飼料，避光風干后，自封袋密封保存于陰涼干燥處備用。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平（干物質基礎）Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet（DM basis）

1.2 養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗在江西農業(yè)大學水產養(yǎng)殖基地中進行，養(yǎng)殖箱為88 cm×66 cm×64 cm 藍色塑料桶，在養(yǎng)殖箱內放置一定數(shù)量的水葫蘆，養(yǎng)殖用水為經過曝氣的自來水。光周期為自然周期，每次喂食記錄水溫，喂食至大部分黃鱔停止攝食為止，并略帶剩余，0.5 h 后觀察并撈出剩料、風干計重。整個試驗期間水溫20.5～28.7 ℃，溶解氧不低于5 mg/L，pH 為6.5～7.4，氨氮濃度不高于2.0 mg/L 和亞硝酸濃度不高于0.10 mg/L。

1.3 樣品采集和相關計算

養(yǎng)殖56 d 后停食24 h，對各養(yǎng)殖箱計數(shù)及稱重，計算增重率、特定生長率（%/d）和飼料系數(shù)，相關計算公式如下：

式中：W1、W2分別代表試驗黃鱔初均重和末均重（g）；t代表養(yǎng)殖天數(shù)（d）；F代表平均攝食量（g）。

從各箱中隨機選取4 尾接近均重的黃鱔運回實驗室解剖取樣。準確稱重、測量體長后斷尾采血，采血完成后將黃鱔置于無菌冰盤上進行解剖，取肝臟組織浸泡于4%多聚甲醛溶液，用于制備HE 染色切片。血液于4 ℃環(huán)境靜置24 h，取上清液于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.4 組織HE切片分析

在光學顯微鏡（BM2000D江南永新光學儀器有限公司）下觀察肝臟組織切片，并拍照，使用軟件ScopeImage 9.0 對切片進行標注。

1.5 營養(yǎng)成分測定

飼料營養(yǎng)成分測定采用相同方法；水分含量測定參考GB/T 6435—2014；粗灰分含量測定參考GB/T 6438—2007；粗脂肪含量測定參考GB/T 6433—2006；粗蛋白質含量測定參考GB/T 6432—1994；飼料維生素A含量檢測參照GB/T 17817—2010。

1.6 血清生化指標測定

嚴格按照南京建成生物工程研究試劑盒的說明書測定血清谷草轉氨酶活性（GOT）、谷丙轉氨酶活性（GPT）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（T-CHO）含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

結果采用平均值±標準誤（mean±SE）表示，用SPSS 25.0進行單因素方差分析（one-way ANOVA），若組間差異顯著，再用Duncan’s氏多重比較檢驗，顯著水平為P＜0.05?；貧w折線利用Excel 2019制作分析。

2 結果與分析

2.1 飼料維生素A水平對黃鱔生長性能的影響

由表2 可知，飼料維生素A 水平對黃鱔的末均重（FBW）、增重率（WGR）和特定生長率（SGR）有顯著影響（P＜0.05），L3組黃鱔的FBW、WGR 和SGR 最高，顯著高于L1組（P＜0.05），與其他組無顯著差異（P＞0.05）。各組飼料系數(shù)（FCR）、存活率（SR）無顯著差異（P＞0.05）。作折線回歸分析飼料維生素A水平與WGR的關系（圖1），黃鱔對飼料維生素A的適宜水平為3 482 IU/kg。

圖1 飼料維生素A水平與黃鱔WGR之間的關系Fig.1 Relationship between dietary vitamin A levels and WGR of Monopterus albus

表2 飼料維生素A水平對黃鱔生長性能的影響Tab.2 Effects of dietary vitamin A levels on growth performance of Monopterus albus（n=4）

2.2 飼料維生素A對黃鱔形體參數(shù)和臟體指數(shù)的影響

由表3可知，飼料維生素A添加水平對幼鱔肝體指數(shù)、脾體指數(shù)和肥滿度無顯著影響（P＞0.05），脾體指數(shù)有先升高后降低的趨勢。

表3 不同維生素A添加水平對黃鱔形態(tài)參數(shù)的影響Tab.3 Effects of different vitamin A levels on morphological parameters of Monopterus albus（n=8）

2.3 飼料維生素A對黃鱔血清生化指標的影響

飼料維生素A 添加水平對幼鱔血清生化指標的影響見表4。隨飼料維生素A 添加水平的升高，血清GOT 和GPT 呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，L7 組血清GOT 最高，L1 組次之，顯著高于L2～L6 組（P＜0.05），L2～L6 組無顯著差異（P＞0.05）。L7 組血清GPT 顯著高于L1～L5 組（P＜0.05），L6 組次之，顯著高于L2～L4組，且L1～L5組間無顯著差異（P＞0.05）。血清總T-CHO 和TG含量隨飼料維生素A水平升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，L5組T-CHO 含量顯著高于L1、L6和L7組（P＜0.05），與L2～L4組無顯著差異（P＞0.05），L3組TG含量最高，L6組次之，L1、L2、L5和L7組最低。

表4 不同維生素A添加水平對黃鱔血清生化指標的影響Tab.4 Effects of different vitamin A levels on serum biochemical indexes of Monopterus albus（n=4）

2.4 飼料維生素A對黃鱔肝臟顯微結構的影響

L1 組黃鱔肝細胞排列沒有規(guī)律，肝細胞腫大，細胞核偏移至一側，部分細胞核消失，部分肝細胞破裂。L2～L5 組黃鱔肝臟結構較為完整，肝小葉結構明顯，細胞核明顯且多數(shù)位于細胞中央。L6、L7 組黃鱔肝細胞出現(xiàn)空泡化，細胞無核或核偏移數(shù)量多。

圖2 飼料維生素A添加水平對黃鱔肝臟顯微結構的影響Fig.2 Effect of dietary vitamin A levels on liver microstructure of Monopterus albus

3 討論與結論

生長性能（主要是WGR）是用于評估適宜維生素A 需求的常見評價指標，但在某些情況下，也會使用缺乏或過量攝入的臨床癥狀、最大肝臟儲備水平作為評價指標[31]。本試驗中，喂食維生素A 水平為2 910 IU/kg 組黃鱔的WGR、SGR顯著低于3 520 IU/kg組，表明飼料維生素A水平低于2 910 IU/kg時會影響小規(guī)格黃鱔的生長速度，以黃鱔WGR 作為評價指標，通過折線回歸分析小規(guī)格黃鱔飼料維生素A 的適宜水平為3 482 IU/kg（圖1）。這與青魚幼魚[32]、大口黑鱸（Micropterus salmoides）[33]和花鱸[5]等報道基本一致，飼料維生素A不足會導致魚類生長減緩。

肝臟在維生素A的代謝、攝取、儲存和釋放中起著重要作用[35]。在魚類中，膳食中缺乏維生素A已被證明會導致魚體肝臟損傷和肝臟體積減小。Taveekijakarn[35]等觀察到大馬哈魚（Oncorhynchus keta）在維生素A 缺乏的飼料中喂養(yǎng)22周后出現(xiàn)肝臟損傷，包括肝板分離和肝細胞萎縮和壞死。本試驗中，L1、L6和L7組肝臟細胞較其他組肝細胞偏大，細胞核消失數(shù)量較多，L6和L7組肝細胞出現(xiàn)空泡化。飼喂缺乏維生素A 飼料的幼建鯉（Cyprinus carpiovarJian）的肝體指數(shù)顯著降低[36]。在日本比目魚中，Hernandez[29]等發(fā)現(xiàn)飼喂不同維生素A 水平魚的肝體指數(shù)沒有顯著差異，但飼喂不添加維生素A 飼料的魚肝體指數(shù)值較低。本試驗結果表明，飼料維生素A 對黃鱔肝體指數(shù)、脾體指數(shù)和肥滿度無顯著影響。一般來說，血清GOT 和GPT 活性可反映肝臟受損程度，這兩種酶通常在暴露于毒素、壓力、疾病或營養(yǎng)不良的魚類中作為評估之一[37]。Hernadez 等[29]等研究了飼料中維生素A 缺少或者過量對日本比目魚血清GOT 和GPT 活性的影響，以其評價比目魚肝臟的損傷程度，結果發(fā)現(xiàn)，對照組和添加25 000 IU/kg 維生素A 試驗組比目魚血清中GOT 和GPT 活性顯著高于其他試驗組，說明飼料中過少或過多的維生素A 都會對肝臟造成損傷。為進一步驗證黃鱔肝臟組織是否受損，試驗測定了黃鱔血清轉氨酶活性，其中L1 和L7 組血清轉氨酶活性顯著高于L3～L5，說明在飼料維生素A 不足或過量，黃鱔肝臟可能受到一定程度損傷。這與吉富羅非魚[15]和花鱸[5]的研究結果一致。

魚類血清中T-CHO 和TG的含量一定程度上反映了機體脂質代謝情況，T-CHO 和TG都主要在肝臟中合成[38]。本試驗中，黃鱔血清T-CHO 和TG 含量隨飼料維生素A 增加呈先上升后下降的趨勢。張璐[5]等研究發(fā)現(xiàn)，維生素A 缺乏組（245 IU/kg）花鱸血清T-CHO 和TG 含量顯著低于正常組，且與肝臟脂肪含量的變化情況是一致，推測維生素A 缺乏時，花鱸營養(yǎng)不良且肝臟可能受到損傷；當飼料維生素A 含量達到15 273 IU/kg時，血清T-CHO和TG顯著下降，過量的維生素A對花鱸肝臟造成了一定毒害作用。本試驗得到了相似結果，飼料維生素A含量不足或者過量可能會影響黃鱔肝臟脂質代謝。

以WGR 作為評價指標，折線分析得出黃鱔對飼料維生素A 的適宜水平為3 482 IU/kg，綜合生產性能、肝功能和肝臟顯微結構考慮，黃鱔適宜維生素A 水平為3 230～5 020 IU/kg。飼料維生素A 不足（2 910 IU/kg）時，生長速度減緩。飼料維生素A 水平過高（7 030 IU/kg）時，不會顯著降低生長速度，但對肝臟產生一定的負面影響。