李 震，易 瑤，何旭江，黃 強(qiáng)，劉一博，曾志將*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045；2.江西省蜜蜂生物學(xué)與飼養(yǎng)重點實驗室，江西 南昌 330045；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004）

【研究意義】蜜蜂蜂王是蜂群的核心，蜂王質(zhì)量優(yōu)劣不僅直接關(guān)系到蜂群群勢強(qiáng)弱以及蜂產(chǎn)品產(chǎn)量高低[1-2]。蜜蜂的授粉行為對全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)都具有極其重要的促進(jìn)作用[3-4]。但2006 年美國暴發(fā)的蜂群衰竭失調(diào)?。–olony Collapse Disorder，CCD）引發(fā)了北美授粉危機(jī)，具體表現(xiàn)為蜂群內(nèi)大量工蜂突然失蹤，只留有蜂王、大量幼蟲和少量工蜂[5]。研究表明，CCD 的暴發(fā)與蜂王質(zhì)量密切相關(guān)[6]。幼蟲日齡、食物來源、生活空間、DNA 甲基化和母體效應(yīng)等因素均參與了蜂王的發(fā)育調(diào)節(jié)[7-10]。盡管關(guān)于DNA 甲基化調(diào)節(jié)蜂王發(fā)育已有諸多報道[9,11-12]，但DNA 甲基化在蜜蜂群體內(nèi)的遺傳規(guī)律尚不清晰。而深入解析西方蜜蜂DNA 甲基化遺傳調(diào)控機(jī)制，能夠為優(yōu)育蜂王提供理論指導(dǎo)，同時也為解決CCD 問題提供新思路。【前人研究進(jìn)展】Kucharski 等[10]發(fā)現(xiàn)，蜂王食物中的營養(yǎng)物質(zhì)通過介導(dǎo)DNA 甲基化來調(diào)節(jié)蜜蜂級型分化，這首次在分子水平上揭示了DNA 甲基化對蜜蜂表觀遺傳現(xiàn)象。此外，Shi 等[8]報道王臺大小也會影響蜜蜂的DNA 甲基化，進(jìn)而調(diào)節(jié)蜜蜂的級型分化。本研究組前期發(fā)現(xiàn)：隨著移植蜂王幼蟲日齡的增加，所培育出蜂王的出生重、胸部長度和寬度均逐漸減??；與低日齡蜂王幼蟲培育出的蜂王相比，由3 日齡的幼蟲培育出的蜂王的整體DNA 甲基化水平最高[13]。同時，蜂王的差異性DNA 甲基化區(qū)域（Differential DNA Methylated Regions，DMRS）在連續(xù)幾代中有累積效應(yīng)[14]。蜜蜂DNA 甲基化可通過父系遺傳印跡[15]。DNA 甲基化是表觀遺傳信息穩(wěn)定跨帶傳遞的媒介，也是最早開始研究的表觀遺傳遺傳信息載體[16-17]?！颈狙芯壳腥朦c】目前還不清楚蜜蜂DNA 甲基化是否與斑馬魚（Brachydanio rerio）、果蠅（Drosophilid）、長牡蠣（Crassostrea gigas）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等模式生物一樣具有母系表觀遺傳印跡特性[18-21]，也不清楚環(huán)境（移蟲日齡）對蜜蜂DNA 甲基化表觀遺傳印跡的影響[22]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用蜂王單雄授精技術(shù)成功培育出1 只單雄授精產(chǎn)卵蜂王G0，并人工建立了1 個具有3 種蜂王后代的品系（分別利用3 日齡卵、1 日齡幼蟲和2 日齡幼蟲所培育出的G1 蜂王）。待G1 代蜂王交尾產(chǎn)卵后，擬采集G0 代蜂王、G1 代蜂王和G1 代蜂王產(chǎn)的雄蜂進(jìn)行全基因組DNA 甲基化測序來系統(tǒng)探究西方蜜蜂DNA 甲基化表觀遺傳印跡特性，以及移蟲日齡對西方蜜蜂DNA 甲基化表觀遺傳印跡影響，以期探明DNA 甲基化調(diào)控西方蜜蜂蜂王發(fā)育的分子機(jī)理，進(jìn)一步揭示移蟲日齡調(diào)控蜂王及后代雄蜂發(fā)育的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗蜂群：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的西方蜜蜂（A.mellifera），試驗時間：2018 年3—10 月，按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行飼養(yǎng)。試驗試劑：OMEGA組織DNA提取試劑盒（Omega Bio-Tek，美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蜜蜂取樣方法 將1只單雄人工授精并成功產(chǎn)卵的蜂王（G0），限制在免移蟲塑料巢脾上產(chǎn)卵6 h。對G0 代蜂王進(jìn)行單雄授精，G0 代蜂王產(chǎn)卵后，以卵（E）、1 日齡工蜂幼蟲（L1）和2 日齡幼蟲（L2）分別培育蜂王（G1代，以卵培育的蜂王簡稱G1E，以1日齡幼蟲培育的蜂王簡稱G1L1，以2日齡幼蟲培育的蜂王簡稱G1L2），然后以G1 代蜂王產(chǎn)卵培育雄蜂（G2 代，G1E 產(chǎn)的雄蜂簡稱G2DE，G1L1 產(chǎn)的雄蜂簡稱G2DL1，G1L2產(chǎn)的雄蜂簡稱G2DL2）。采樣方法見圖1。

圖1 樣品采集Fig.1 Samples collection

1.2.2 全基因DNA 甲基化測定方法 取G0、G1E、G1L1、G1L2 蜂王以及G2DE、G2DL1、G2DL2 雄蜂，將其頭、胸組織提取DNA 后送往北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行全基因組甲基化測序。上機(jī)測序后得到的原始數(shù)據(jù)均已上傳NCBI，提交序列號為SUB9847854，數(shù)據(jù)序列號為PRJNA737625。將原始數(shù)據(jù)刪除低質(zhì)量數(shù)據(jù)和測序接頭來得到高質(zhì)量的clean data。以西方蜜蜂基因組（Amel_HAv3.1 版本）為參考序列，采用Bismark 軟件將甲基化數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對分析[23]。首先去除甲基化數(shù)據(jù)中的重復(fù)部分；然后以比對上的參考基因組的C 位點的堿基類型：若比對上的堿基為C，則判定該位點發(fā)生了甲基化；若為T，則未發(fā)生甲基化。甲基化水平的計算公式為：

式（1）中：ML為甲基化水平；mC為甲基化C的數(shù)量；umC未甲基化C的數(shù)量。

1.2.3 原有高甲基化位點和突變高甲基化位點統(tǒng)計 參照Liu等[24]的方法，選取ML≥0.8的位點為高甲基化位點。原有高甲基化位點指的是高甲基化位點從G0傳遞到G1、G2時共有的個數(shù)；突變高甲基化位點的研究對象是G0代蜂王的低甲基化位點遺傳到G1代蜂王和G2代雄蜂時變?yōu)楦呒谆稽c。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

利用SPSS25.0進(jìn)行分析雄蜂甲基化的數(shù)據(jù)。數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，并通過單因素方差分析（one-way ANOVA）和Fisher's LSD檢驗進(jìn)行分析。P＜0.05表示數(shù)據(jù)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA整體甲基化測序質(zhì)量

18 個樣品的平均clean reads 數(shù)為3 820 492，平均clean base 為9.90 G，Q20 的平均為96.70%，Q30 的平均值為91.69%，亞硫酸氫鹽的平均轉(zhuǎn)化率為99.70%（表1）。

表1 甲基化測序結(jié)果統(tǒng)計Tab.1 Statistics quality of DNA methylation sequencing

2.2 DNA甲基化遺傳表觀印跡特性

2.2.1 原有高甲基化位點遺傳印跡 從圖2 可見：以卵和1 日齡幼蟲培育的G1 代蜂王（G1E、G1L1），分別從G0代蜂王中遺傳了57.6%和57.4%的高甲基化位點，遠(yuǎn)低于以2日齡幼蟲培育的G1代蜂王（G1L2）遺傳的79.5%高甲基化位點。同樣，G1E 和G1L1 所產(chǎn)的雄蜂（G2DE，G2DL1）分別遺傳了來自G0 的36.5%和39.2%高甲基化位點，也遠(yuǎn)低于G2DL2從G0遺傳的51.3%高甲基化位點。

圖2 原有DNA高基化位點遺傳印跡Fig.2 Intergenerational marks of original high-methylation loci

2.2.2 突變高甲基化位點遺傳印跡 從圖3可見：G1代蜂王（G1E，G1L1，G1L2）從G0代蜂王遺傳的突變高甲基化位點隨著移蟲日齡的增加而增加；G2DE、G2DL1和G2DL2從各自母本蜂王（G1E、G1L1和G1L2）中遺傳了40.1%、38.7%和35.4%的高甲基位點。雖然遺傳的高甲基化位點比例隨著移蟲日齡增加而減少，但G2代雄蜂（G2DE，G2DL1，G2DL2）從G1代蜂王遺傳的高甲基化位點隨著移蟲日齡的增加而增加。

圖3 突變高基化位點遺傳印跡Fig.3 Intergenerational marks of mutational high-methylation loci

2.3 移蟲日齡對DNA甲基化遺傳表觀印跡影響

2.3.1 移蟲日齡對原有高甲基化位點遺傳的影響 從圖4 可見：G2DL2 從G0 代蜂王遺傳到的原有高甲基化位點顯著高于G2DE和G2DL1從G0代蜂王遺傳到的原有高甲基化位點（P＜0.05）。

圖4 移蟲日齡對原有高甲基化位點遺傳的影響Fig.4 The effect of the age of immigrants on the inheritance of the original high-methylation loci

2.3.2 移蟲日齡對突變高甲基化位點遺傳的影響 從圖5可見：隨著移蟲日齡的增加，從G0代蜂王遺傳印跡到G2 代雄蜂的突變高甲基化位點數(shù)目隨之增加。且G2DL2 遺傳到的突變高甲基化位點顯著高于G2DE和G2DL1（P＜0.05）。

圖5 移蟲日齡對突變高甲基化位點遺傳的影響Fig.5 The effect of the age of immigrants on the inheritance of the mutational high-methylation loci

2.4 高甲基化位點遺傳印跡模式圖

研究結(jié)果揭示了3個調(diào)控蜜蜂級型分化的關(guān)鍵基因高甲基化位點遺傳印跡模式（圖6）。LOC409393基因高甲基化位點遺傳印跡模式圖揭示了一些原有高甲基化位點能夠從G0 代蜂王穩(wěn)定遺傳印跡到G2代雄蜂（圖6A）。LOC409393 和LOC408438 高甲基化位點遺傳印跡模式圖則進(jìn)一步證明了隨著移蟲日齡增加，所培育G1 代蜂王從G0 代蜂王獲得的高甲基化位點數(shù)目增多，且G2 代雄蜂從G1 代蜂王處獲得的高甲基化位點數(shù)目同樣增多（圖6A，圖6B和圖6C）。

圖6 3個基因的高甲基化位點遺傳印跡模式Fig.6 Intergenerational marks patterns of methylation sites with 3 genes

3 討論與結(jié)論

DNA 甲基化普遍存在于動植物和真菌等基因組中，是目前研究最廣泛的表觀修飾機(jī)制。大量研究表明：DNA 甲基化調(diào)控蜜蜂級型分化過程，進(jìn)而影響蜂王發(fā)育質(zhì)量[11-15]，但仍然有許多研究問題還不清楚，比如蜜蜂DNA甲基化與蜂王質(zhì)量關(guān)系；蜜蜂DNA甲基化能否母系表觀遺傳印跡。

Shi 等[11]發(fā)現(xiàn)工蜂DNA 甲基化水平是隨著幼蟲日齡增高，而蜂王DNA 甲基化水平是先升高然后下降。Yi 等[14]首次發(fā)現(xiàn)在逐代培育蜂王過程中，DNA 甲基化存在累代現(xiàn)象。本研究首次發(fā)現(xiàn)原有高甲基化位點和突變甲基化位點都存在表觀遺傳印跡現(xiàn)象，有助于解釋蜂王與工蜂DNA 甲基化水平差異及累代現(xiàn)象。而Yi等[13]發(fā)現(xiàn)移蟲日齡的增加，所培育的蜂王初生重、胸長和胸寬等指標(biāo)逐步下降，而3日齡蜂王整體DNA 甲基化水平卻逐步提高；Yi 等[25]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：蜂王質(zhì)量隨著移蟲日齡的增加而降低，同時隨著移蟲日齡的增加，移蟲培育的蜂王與移卵培育的蜂王之間的差異甲基化基因數(shù)量逐步增多，差異甲基化基因涉及蜜蜂級型分化、壽命、免疫、發(fā)育等重要途徑。本試驗首次發(fā)現(xiàn)：現(xiàn)隨著移蟲日齡增加，原有高甲基化位點和突變高甲基化位點遺傳印跡數(shù)量都是逐步增加。

DNA 甲基化位于啟動子區(qū)時抑制基因的表達(dá)，但當(dāng)甲基化位于基因區(qū)時，它不僅不抑制基因的表達(dá)，相反還會起到促進(jìn)作用[26]。有研究表明：基因區(qū)甲基化程度小于70%時正向調(diào)控基因表達(dá)，大于70%時會起負(fù)調(diào)控作用[27]。本試驗選取外顯子上甲基化程度大于和等于80%的位點作為高甲基化位點，因此基因區(qū)高甲基化位點數(shù)目越多，其自身表達(dá)將會進(jìn)一步受到抑制。LOC408438和LOC409393基因被干擾或剪切時，蜂王幼蟲會在實驗室培育條件下轉(zhuǎn)向完整工蜂形態(tài)發(fā)育，并出現(xiàn)卵巢管數(shù)減少這一生殖退化現(xiàn)象[28-29]。而LOC408438 和LOC409393 基因的高甲基化位點遺傳印跡模式圖揭示了在使用2 日齡以上（包括2 日齡）的幼蟲人工培育蜂王時，會造成蜂王和后代雄蜂獲得的更多的高甲基化位點，這或許會導(dǎo)致培育的蜂王出現(xiàn)質(zhì)量下降現(xiàn)象[14]，進(jìn)而降低整個蜂群繁衍。

因此，在當(dāng)前西方蜜蜂大規(guī)模商業(yè)飼養(yǎng)的大背景下，建議養(yǎng)蜂者應(yīng)優(yōu)先利用卵和1 日齡小幼蟲來培育優(yōu)質(zhì)蜂王，提高蜂群的繁殖和存續(xù)能力，達(dá)到預(yù)防發(fā)生CCD 的目的，本研究結(jié)果進(jìn)一步解釋了蜜蜂DNA甲基化與蜂王質(zhì)量關(guān)系，為在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中人工培育優(yōu)質(zhì)蜂王和CCD防控提供了全新思路。