朱曉娟，代海濤，李 艷，崔靈欣，王 亞，徐 江，仵 楠

0 引 言

牙周炎是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，與糖尿病之間存在密切的雙向關(guān)系[1]。近年來，糖尿病牙周炎的治療越來越受到重視，但目前針對(duì)糖尿病患者的牙周炎癥尚缺少有效的控制手段。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins extract，GSPE)是從葡萄籽內(nèi)分離出的一種富含多酚類的提取物，具有血管舒張、抗氧化、改善血管內(nèi)皮功能、抗炎、降脂等作用[2-4]。近年來，越來越多的科研工作者開始關(guān)注原花青素在輔助治療糖尿病方面的作用，但GSPE對(duì)糖尿病牙周炎是否具有保護(hù)作用目前國內(nèi)外鮮少報(bào)道。為此，本研究通過建立糖尿病牙周炎大鼠模型，嘗試探究GSPE對(duì)大鼠血糖、血清脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6及牙周組織炎性狀態(tài)變化的影響。

1 材料與方法

1.1 分組、造模及給藥6周齡雄性SD大鼠50只，體重為(210±10)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2018-0002]，飼養(yǎng)于石河子大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境：溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。本研究中所有實(shí)驗(yàn)方案均得到石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行動(dòng)物研究(批件號(hào)：A2021-073-01)。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)等分為5組，即對(duì)照組、單純牙周炎組、糖尿病牙周炎組、單純牙周炎GSPE干預(yù)組、糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組。對(duì)照組不做任何處理，正常飼料喂養(yǎng)。糖尿病牙周炎組和糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，4周后腹腔注射45 mg/kg鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病，注射3 d后取尾靜脈測(cè)空腹血糖，連續(xù)3 d空腹血糖≥15 mmol/L、第7天空腹血糖≥16.7 mmol/L，則視為糖尿病模型建立成功。糖尿病建模成功1周后，除對(duì)照組外，其余4組大鼠均給予腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛(300～350 mg/kg)麻醉，采用0.2 mm結(jié)扎絲結(jié)扎于雙側(cè)上頜第一磨牙牙頸部。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：肉眼檢査大鼠牙齦組織有充血、出血、腫脹、溢膿、潰瘍和糜爛等現(xiàn)象，且牙齦指數(shù)≥2，即牙周炎建模成功。國際通用牙齦指數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]：牙齦健康為0分；牙齦輕度炎癥，即牙齦的顏色有輕度改變并有輕度水腫，探診不出血為1分；牙齦有中等炎癥，即牙齦色紅，水腫光亮，探診出血為2分；牙齦有嚴(yán)重炎癥，即牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動(dòng)出血傾向?yàn)?分。模型建立成功后單純牙周炎GSPE干預(yù)組、糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組每日定時(shí)給予GSPE 100 mg/kg灌胃，對(duì)照組、單純牙周炎組和糖尿病牙周炎組給予等量的等滲鹽水灌胃。連續(xù)給藥8周后，10%水合氯醛麻醉大鼠后取腹主動(dòng)脈血，血液樣本3200×g離心10 min后取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。然后處死大鼠，留取上頜骨備用。

1.2主要試劑及儀器葡萄籽原花青素提取物(天津尖峰天然產(chǎn)物公司)，鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)(美國 Sigma 公司)，血糖儀(羅氏診斷公司)，大鼠脂聯(lián)素的ELISA試劑盒(上海隆壘生物科技有限公司)，TNF-α、IL-6的ELISA試劑盒(北京晶美生物公司)

1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 體重及空腹血糖測(cè)定所有大鼠在給藥后第2、4、6、8周測(cè)量體重，血糖檢測(cè)儀測(cè)量空腹血糖值。

1.3.2牙周炎癥評(píng)估牙齦指數(shù)和齦溝出血指數(shù)：采用國際通用牙齦指數(shù)[5]和齦溝出血指數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙牙齦情況及齦溝出血情況記分[6]。

牙槽骨吸收高度：取右側(cè)上頜骨，去除結(jié)扎線，4%多聚甲醛固定48 h，流水沖洗12 h后剝離表面軟組織，亞甲藍(lán)染10 min，流水沖洗去除多余亞甲藍(lán)，晾干后用游標(biāo)卡尺測(cè)量第一磨牙釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂之間的距離(界嵴距)，測(cè)量位點(diǎn)為該牙頰側(cè)和腭側(cè)近中、中、遠(yuǎn)中6個(gè)位點(diǎn)，取均值。

牙槽骨吸收高度=該組界嵴距-對(duì)照組界嵴距

牙周組織病理學(xué)觀察：取左側(cè)上頜骨，去除結(jié)扎線，4%多聚甲醛固48 h后置于10%的乙二胺四乙酸鈉(EDTA)溶液中常溫下脫鈣8周，每隔4 d換1次脫鈣液，常規(guī)脫水、石蠟包埋，沿第一磨牙牙體長軸頰舌方向制作厚度為5 μm的切片，每個(gè)樣本取牙周結(jié)構(gòu)完整切片進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠牙周組織形態(tài)變化。

1.3.3血清脂肪因子與炎癥因子檢測(cè)按試劑盒操作流程測(cè)定血清脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況對(duì)照組、單純牙周炎組和單純牙周炎GSPE干預(yù)組大鼠一般狀況良好，毛發(fā)光亮，行動(dòng)敏捷，代謝正常，攝食量、飲水量及尿量均正常；糖尿病牙周炎組大鼠狀況較差，精神萎靡，體型消瘦，毛發(fā)暗淡無光澤，弓背蜷體，行動(dòng)較遲緩，反應(yīng)遲鈍，攝食量、飲水量及尿液量均有所增加。與糖尿病牙周炎組相比，糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組大鼠的一般狀況有所改善。

2.2體重及血糖變化比較對(duì)照組、單純牙周炎組和單純牙周炎GSPE干預(yù)組大鼠隨著正常的生長發(fā)育，體重不斷增加，且組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而糖尿病牙周炎組和糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組大鼠體重逐漸減輕。GSPE干預(yù)8周后，糖尿病牙周炎組大鼠體重明顯低于糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組(P=0.007)。見表1。

表1 各組大鼠體重變化比較

對(duì)照組、單純牙周炎組和單純牙周炎GSPE干預(yù)組大鼠血糖始終處于正常水平。糖尿病牙周炎組和糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組血糖明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；糖尿病牙周炎組血糖顯著高于糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖含量變化比較

2.3牙齦指數(shù)、齦溝出血指數(shù)、牙槽骨吸收高度比較與對(duì)照組相比，單純牙周炎組和糖尿病牙周炎組牙齦指數(shù)、齦溝出血指數(shù)及牙槽骨吸收高度明顯升高(P<0.05)；與單純牙周炎組相比，糖尿病牙周炎組牙齦指數(shù)、齦溝出血指數(shù)及牙槽骨吸收高度明顯升高(P<0.05)，單純牙周炎GSPE干預(yù)組牙齦指數(shù)、齦溝出血指數(shù)及牙槽骨吸收高度明顯降低(P<0.05)；與糖尿病牙周炎組相比，糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組牙齦指數(shù)、齦溝出血指數(shù)及牙槽骨吸收高度降低(P<0.05)；與單純牙周炎GSPE干預(yù)組相比，糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組牙齦指數(shù)、齦溝出血指數(shù)及牙槽骨吸收高度明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 牙周炎大鼠治療后各項(xiàng)指標(biāo)觀察

2.4牙周組織病理檢查結(jié)果對(duì)照組為正常牙周組織，牙齦上皮完整，結(jié)合上皮根方位于釉牙骨質(zhì)界處，無附著喪失，結(jié)締組織未見明顯炎細(xì)胞浸潤，牙槽骨未見明顯吸收；單純牙周炎組牙齦上皮糜爛，結(jié)締組織內(nèi)炎細(xì)胞浸潤，結(jié)合上皮向根方增殖；糖尿病牙周炎組見大量炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)合上皮向根方增殖，牙槽骨吸收，出現(xiàn)明顯的骨吸收陷窩；單純牙周炎GSPE干預(yù)組和糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組牙齦上皮較完整，可見少量炎細(xì)胞浸潤，牙周膜連續(xù)，膠原纖維出現(xiàn)增生，有成骨細(xì)胞和新生骨生成。見圖1。

a：對(duì)照組；b：?jiǎn)渭冄乐苎捉M；c：糖尿病牙周炎組；d：?jiǎn)渭冄乐苎譍SPE干預(yù)組；e：糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組(箭頭指向釉質(zhì)牙骨質(zhì)界)

2.5血清脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6對(duì)照組、單純牙周炎組和單純牙周炎GSPE干預(yù)組血清脂聯(lián)素水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組相比，糖尿病牙周炎組脂聯(lián)素水平顯著降低(P<0.01)；與糖尿病牙周炎組相比，糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組脂聯(lián)素水平明顯升高(P<0.01)。單純牙周炎組和糖尿病牙周炎組血清TNF-α及IL-6水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；糖尿病牙周炎組IL-6及TNF-α水平明顯高于單純牙周炎組(P<0.05)；單純牙周炎GSPE干預(yù)組IL-6及TNF-α水平明顯低于單純牙周炎組(P<0.05)；糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組IL-6及TNF-α水平明顯低于糖尿病牙周炎組(P<0.05)；糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組IL-6及TNF-α水平明顯高于單純牙周炎GSPE干預(yù)組(P<0.05)。見表4。

表4 GSPE對(duì)各組大鼠血清脂聯(lián)素、IL-6、TNF-α的影響

3 討 論

糖尿病是一種由多病因引起的代謝性疾病，其特征是患者的血糖長期高于標(biāo)準(zhǔn)值，機(jī)體長期高血糖狀態(tài)會(huì)危及多種組織，特別是眼、腎、心血管等[7]。牙周炎是一種由菌斑引發(fā)的侵犯牙齦和牙周組織的慢性炎癥，是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的主要原因，嚴(yán)重危害患者的生活品質(zhì)和口腔健康[8]。牙周炎與糖尿病的關(guān)系已經(jīng)得到全球牙周病學(xué)專家共識(shí)，并特別指出糖尿病能顯著影響牙周病的進(jìn)程，是牙周病的重要描述因子[9]。有研究表明，糖尿病患者患牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)是沒有糖尿病的人的2～3倍[10]。牙周炎又被稱為糖尿病的第六大并發(fā)癥[11]。近年來，糖尿病牙周炎的治療越來越被人們重視。GSPE因其具有良好的清除自由基、提高抗氧化能力、抗腫瘤及調(diào)節(jié)血糖血脂的作用被廣泛關(guān)注[12]。有多項(xiàng)研究表明GSPE具有改善肥胖相關(guān)代謝并發(fā)癥的能力，包括降低血壓、調(diào)節(jié)血脂、改善炎癥和胰島素抵抗[13]。Yoko等[14]發(fā)現(xiàn)原花青素還能以劑量依賴性的方式通過口服糖耐量試驗(yàn)來起到抑制急性高血糖的作用。Toker等[15]研究證實(shí)，GSPE能夠減少糖尿病牙周炎大鼠牙槽骨吸收，減輕牙周炎癥，增加成骨細(xì)胞活性。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與單純牙周炎組相比，糖尿病牙周炎組牙周炎癥更加嚴(yán)重，說明糖尿病會(huì)加重牙周炎發(fā)展；經(jīng)GSPE干預(yù)后，單純牙周炎GSPE干預(yù)組和糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組牙周炎癥情況均有所改善，表明GSPE具有改善牙周炎癥作用，與Toker等研究結(jié)果一致。另外，糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組血糖明顯低于糖尿病牙周炎組，說明GSPE有降低血糖能力。研究還表明，控制血糖可明顯減輕糖尿病對(duì)牙周組織的破壞，增強(qiáng)牙周組織的修復(fù)能力。

脂聯(lián)素是一種由脂肪細(xì)胞特異性分泌的蛋白質(zhì)，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一與機(jī)體脂質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)的脂肪因子，它在許多疾病的生理和病理過程中發(fā)揮著重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，具有糾正血糖血脂紊亂、抗炎、胰島素增敏、心血管保護(hù)等功能[16]。脂聯(lián)素可加快吸收骨骼肌細(xì)胞糖類及脂肪酸氧化，促進(jìn)胰島素抑制糖原異生途徑，調(diào)節(jié)糖脂代謝，因而提出血清脂聯(lián)素水平可作為糖尿病發(fā)生的預(yù)測(cè)因子[17-18]。另外，研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素在抑制促炎細(xì)胞因子刺激的同時(shí)也能促進(jìn)抗炎介質(zhì)的排放[19]。脂聯(lián)素還可通過抑制活性氧表達(dá)對(duì)牙周組織起到一定的保護(hù)作用[20-21]。因此，有理由推測(cè)脂聯(lián)素在糖尿病和牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起到相互影響作用。在本研究中，單純牙周炎組血清脂聯(lián)素水平雖然較對(duì)照組降低，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，糖尿病牙周炎組脂聯(lián)素水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，推測(cè)單純牙周炎不會(huì)引起血清脂聯(lián)素水平降低，但是當(dāng)糖尿病合并牙周炎時(shí)是會(huì)導(dǎo)致血清脂聯(lián)素水平降低。與糖尿病牙周炎組相比，糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組脂聯(lián)素水平升高，說明GSPE能夠升高糖尿病牙周炎大鼠血清脂聯(lián)素水平，調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝。

有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和脂聯(lián)素化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，均可由脂肪細(xì)胞分泌，共用一個(gè)信號(hào)通道，均參與了機(jī)體胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展過程，但發(fā)揮的作為卻截然相反[22]。Aljada等[23]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者肌肉及脂肪組織中TNF-α含量很高，推測(cè)其可能與糖尿病的發(fā)生存在著密切的關(guān)聯(lián)。另外TNF-α是核因子-κB信號(hào)通路的一種促炎因子，在牙周炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中同樣起著重要作用[24]。與TNF-α一樣，IL-6也參與牙周炎的發(fā)生和發(fā)展[25]。研究表明IL-6可以通過增加牙周炎癥組織中的基質(zhì)金屬蛋白-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1)引起組織破壞，MMP-1在細(xì)胞外釋放到牙周炎癥組織中可以通過直接降解膠原蛋白或激或纖溶蛋白酶來破壞結(jié)締組織[26]。本研究結(jié)果顯示，與單純牙周炎組相比，糖尿病牙周炎組血清TNF-α和IL-6水平升高，說明糖尿病會(huì)加重牙周炎大鼠全身炎癥情況。GSPE干預(yù)后，單純牙周炎GSPE干預(yù)組TNF-α和IL-6水平較單純牙周炎組降低，糖尿病牙周炎GSPE干預(yù)組TNF-α和IL-6水平較糖尿病牙周炎組降低，說明GSPE不僅能夠降低單純牙周炎大鼠血清TNF-α和IL-6水平，還能降低糖尿病牙周炎大鼠血清TNF-α和IL-6水平，推測(cè)GSPE通過降低大鼠血清TNF-α和IL-6水平來改善機(jī)體炎癥狀態(tài)。

綜上所述，GSPE能夠降低糖尿病牙周炎大鼠血糖水平，改善牙周組織病理損傷，上調(diào)負(fù)性脂肪因子脂聯(lián)素表達(dá)，降低促炎因子TNF-α、IL-6表達(dá)。本文為臨床治療糖尿病牙周炎提供了新的治療途徑，為探索GSPE防治糖尿病牙周炎提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。