施 冰，薛大衛(wèi)

（解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心健康醫(yī)學(xué)科，北京 100700）

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一種位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，具有促進(jìn)水分子快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓力平衡的功能[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，AQP1、AQP4 在調(diào)節(jié)腦脊液分泌以及水循環(huán)方面起著重要作用，參與了腦水腫、心肌水腫的發(fā)生發(fā)展[1-2]。藥物靶向調(diào)節(jié)水通道蛋白表達(dá)，為防治急性高原病提供了新思路。本研究探索了長(zhǎng)春西汀、紅景天、乙酰唑胺三種藥物防治急性高原腦水腫和心肌水腫的效果，為篩選防治急性高原病新藥提供了新的研究方向和干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組低氧實(shí)驗(yàn)艙（貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司FLYDWC50-C）模擬海拔7 000 m高原環(huán)境，方法同文獻(xiàn)所述一致[3]。雄性SPF 級(jí)SD 大鼠，6 周齡，體質(zhì)量（200±20.19） g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為常壓常氧對(duì)照組（對(duì)照組）、高原低氧模型組（低氧組）、高原低氧+紅景天組（紅景天組）、高原低氧+乙酰唑胺組（乙酰唑胺組）、高原低氧+長(zhǎng)春西汀組（長(zhǎng)春西汀組），每組18 只大鼠。對(duì)照組和低氧組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。藥物干預(yù)組大鼠分別應(yīng)用長(zhǎng)春西?。ㄐ傺览鸫笏帍S，注冊(cè)證號(hào)H20130774，規(guī)格：10 mg/片）25 mg/（kg·d）灌胃；乙酰唑胺（國(guó)外采購(gòu)，規(guī)格：250 mg/片）50 mg（kg·d）灌胃；紅景天（原總后勤部衛(wèi)生部配發(fā)，規(guī)格：0.38 g/粒）78mg/（kg·d）灌胃。每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃7 d 后取材。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)各組大鼠完成實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)用干濕重法評(píng)估心肌組織、腦組織水腫程度；通過(guò)蘇木素- 伊紅染色法，觀察心肌組織、腦組織病理變化；利用RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)心肌組織和腦組織AQP1、AQP4 mRNA 表達(dá)。實(shí)驗(yàn)方法同參考文獻(xiàn)所述一致[4-5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行比較分析。計(jì)量資料以(±s)表示。各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織含水量各組大鼠腦組織含水量檢測(cè)結(jié)果見表1。與對(duì)照組比較，低氧組大鼠腦組織含水量明顯增加（P＜0.05）。與低氧組比較，長(zhǎng)春西汀組、乙酰唑胺組大鼠腦組織含水量有所下降（P＜0.05），紅景天組大鼠腦組織含水量無(wú)顯著變化。

表1 大鼠腦組織含水量比較( ±s)

表1 大鼠腦組織含水量比較( ±s)

注：*P＜0.05，與對(duì)照組相比；#P＜0.05，與低氧組相比。

組別 例數(shù) 對(duì)照組 低氧組 長(zhǎng)春西汀 紅景天 乙酰唑胺腦含水量（%） 18 77.28±0.33 78.87±0.29* 77.87±0.36# 78.49±0.28 77.67±0.35#

2.2 大鼠心肌組織含水量各組大鼠心肌組織含水量檢測(cè)結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，低氧組大鼠心肌組織含水量較對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）。長(zhǎng)春西汀、乙酰唑胺組大鼠心肌組織含水量較低氧組明顯下降（P＜0.05）。紅景天組大鼠心肌組織含水量與低氧組比較，變化不顯著。

表2 大鼠心肌組織含水量比較( ±s )

表2 大鼠心肌組織含水量比較( ±s )

注：*P＜0.05，與對(duì)照組相比；#P＜0.05，與低氧組相比。

組別 例數(shù) 對(duì)照組 低氧組 長(zhǎng)春西汀 紅景天 乙酰唑胺心肌含水量（%） 18 75.38±0.12 78.24±0.53* 77.14±0.64# 77.89±0.11 76.85±0.31#

2.3 qRT-PCR 檢測(cè)大鼠腦組織AQP4 mRNA 的相對(duì)含量大鼠腦組織AQP4 mRNA 的相對(duì)含量檢測(cè)結(jié)果見表3。與對(duì)照組比較，低氧組大鼠腦組織AQP4 mRNA 表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）。與低氧組比較，長(zhǎng)春西汀組、乙酰唑胺組大鼠腦組織AQP4 mRNA 表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。紅景天組大鼠腦組織AQP4 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯變化。

表3 大鼠腦組織AQP4 mRNA 相對(duì)含量比較( ±s)

表3 大鼠腦組織AQP4 mRNA 相對(duì)含量比較( ±s)

注：*P＜0.05，與對(duì)照組相比；#P＜0.05，與低氧組相比。AQP4：水通道蛋白4。

組別 例數(shù) 對(duì)照組 低氧組 長(zhǎng)春西汀 紅景天 乙酰唑胺腦AQP4 18 1.00±0.08 2.76±0.33* 1.94±0.40# 2.36±0.42 1.70±0.32#

2.4 qRT-PCR 檢測(cè)大鼠心肌組織AQP1 mRNA 的相對(duì)含量大鼠心肌組織AQP1 mRNA 的相對(duì)含量檢測(cè)結(jié)果見表4。低氧組大鼠心肌組織AQP1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）。長(zhǎng)春西汀組、乙酰唑胺組大鼠心肌組織AQP1 mRNA 表達(dá)量較低氧組明顯降低（P＜0.05）。紅景天組大鼠心肌組織AQP1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與低氧組比較，無(wú)顯著變化。

表4 大鼠心肌組織AQP1 mRNA 相對(duì)含量比較( ±s)

表4 大鼠心肌組織AQP1 mRNA 相對(duì)含量比較( ±s)

注：*P＜0.05，與對(duì)照組相比；#P＜0.05，與低氧組相比。AQP1：水通道蛋白1。

組別 例數(shù) 對(duì)照組 低氧組 長(zhǎng)春西汀 紅景天 乙酰唑胺心AQP1 18 1.00±0.19 2.61±0.25* 1.93±0.18# 2.46±0.33 1.74±0.26#

2.5 大鼠腦組織HE 染色的形態(tài)學(xué)觀察對(duì)照組大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞漿飽滿、胞核清晰。低氧組大鼠可見部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞水腫、胞核凝聚或碎裂。與低氧組比較，藥物干預(yù)組大鼠腦組織損傷較輕（圖1）。

圖1 光鏡下大鼠腦組織病理學(xué)改變（HE×200）

2.6 大鼠心肌組織HE 染色的形態(tài)學(xué)觀察對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞胞漿飽滿、胞核邊緣清晰、肌纖維排列有序緊密。低氧組大鼠可見部分心肌細(xì)胞肌漿皺縮，胞核邊緣不清，肌纖維排列紊亂疏松。與低氧組比較，藥物干預(yù)組大鼠心肌損傷較輕（圖2）。

3 討論

低壓低氧誘發(fā)的急性腦水腫、心肌水腫是急性高原病最主要的病理改變[6]。盡管發(fā)病率僅為0.05%～2.00%，但由于起病急、變化快，一旦救治不及時(shí)，其病死率將＞10%。如何最大程度地降低急性高原病的發(fā)生率、減少非戰(zhàn)斗減員,一直是高原衛(wèi)勤保障的重點(diǎn)和難點(diǎn)。口服藥物具有攜帶方便、用法簡(jiǎn)單、利用率高等特點(diǎn)，較綜合鍛煉習(xí)服、階梯習(xí)服等干預(yù)措施更適合從平原急進(jìn)高原環(huán)境時(shí)防治急性高原病[7]。

組織缺氧可造成細(xì)胞進(jìn)行無(wú)氧糖酵解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)乳酸超載、滲透壓升高、水液內(nèi)向性滲透導(dǎo)致細(xì)胞毒性水腫[8]。細(xì)胞毒性水腫是急性高原腦水腫、心肌水腫的主要病理變化。水通道蛋白（AQPs）家族中，AQP1 主要位于心肌細(xì)胞膜及微血管內(nèi)皮細(xì)胞，依賴 AQP1 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的水量占心肌水通道蛋白運(yùn)輸總水量的20%～30%[9]。文獻(xiàn)報(bào)道，AQP1 高表達(dá)與心肌水腫程度呈正相關(guān)[10]。心肌水腫容易誘發(fā)室速、室顫、高度房室傳導(dǎo)阻滯等惡性心律失常事件，增加了心力衰竭的發(fā)生率，加重了死亡風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)各種手段下調(diào)AQP1 表達(dá)，可以顯著改善心肌水腫[10]。

AQP4 主要分布在血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足上，其高表達(dá)與細(xì)胞毒性腦水腫程度呈正相關(guān)[11]。高原缺氧可導(dǎo)致大腦組織AQP4 的分布極性發(fā)生改變[12]。AQP4 在血管側(cè)分布減少，而在神經(jīng)元側(cè)分布增加，造成過(guò)多的水分子滯留在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、腦水腫發(fā)生[12]。通過(guò)各種手段下調(diào)AQP4 表達(dá)，可顯著改善腦水腫[12]。

乙酰唑胺（acetazolamide）是FDA推薦的防治急性高原病的首選藥物[13]。作為強(qiáng)效碳酸酐酶抑制劑，乙酰唑胺能夠透過(guò)血腦屏障、抑制腦脊液產(chǎn)生；乙酰唑按可下降A(chǔ)QP4表達(dá)，減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，降低腦組織含水量，減輕腦水腫程度、縮小腦挫傷體積,具有腦保護(hù)作用[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，乙酰唑胺預(yù)處理能下調(diào)肺泡組織AQP1 的表達(dá)，降低高原低氧大鼠肺泡膜的通透性，有效緩解肺水腫，改善缺氧[14]。但是，乙酰唑胺在實(shí)際應(yīng)用中存在明顯不足：一是不良反應(yīng)發(fā)生率較高。長(zhǎng)期服用可造成低鉀血癥等電解質(zhì)紊亂以及急性腎功能衰竭等[15]。二是磺胺過(guò)敏者禁忌服用該藥。三是國(guó)內(nèi)市場(chǎng)長(zhǎng)期無(wú)“乙酰唑胺片”供應(yīng)。四是服用該藥后排尿次數(shù)增多，不適宜軍事作業(yè)環(huán)境等場(chǎng)景。

紅景天是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材。大株紅景天可顯著提高小鼠在低氧混合氣體下的耐缺氧能力，是目前國(guó)內(nèi)常用的防治急性高原病藥物[16]。作為紅景天的主要成分，紅景天苷能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，顯著減輕氧自由基蓄積造成的心肌損害，降低低氧性肺動(dòng)脈高壓[17-18]。此外，紅景天苷能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高神經(jīng)細(xì)胞PI3K 表達(dá)，提高神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)己糖激酶活性和ATP 水平，抑制急性缺氧性神經(jīng)損傷，從而積極防治高原病[19]。但是，紅景天在實(shí)際應(yīng)用中存在明顯不足：紅景天膠囊需在進(jìn)入高原前1～2周開始服用，不適合作為自平原或低海拔地區(qū)緊急進(jìn)入高海拔地區(qū)時(shí)防治急性高原病的藥物。

長(zhǎng)春西?。╲inpocetine）是從夾竹桃科小蔓長(zhǎng)春花提取的生物堿類化合物[20]。自20 世紀(jì)70 年代上市以來(lái)，已有40 余年臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)。長(zhǎng)春西汀能夠通過(guò)血腦屏障作用于腦組織，恢復(fù)、維持腦血管的生理性擴(kuò)張；通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮表達(dá)，增加缺血區(qū)腦血流量和含氧量，改善顱內(nèi)血供[20-21]。臨床主要用于治療腦出血和腦梗死后遺癥。近年來(lái)國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)春西汀可預(yù)防老年性癡呆和認(rèn)知功能障礙，但其用于高原病防治未見相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)春西汀可以通過(guò)下調(diào)心肌組織、腦組織AQP1和AQP4 表達(dá)；減輕急性高原低氧性腦水腫和心肌水腫，效果優(yōu)于紅景天。長(zhǎng)春西汀可能成為未來(lái)急性高原病的防治新藥。