牛 艷，陳 翔，楊 靜，吳 燕，趙子丹，劉 霞

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部枸杞產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，寧夏回族自治區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750002）

枸杞（Lycium barbarumL.）是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，能夠有效清除人體內(nèi)的自由基，具有增強(qiáng)免疫力、防衰老、抗腫瘤、抗氧化、提高有益菌水平、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的功能性恢復(fù)等多方面的藥理作用[1-5]。我國(guó)枸杞的種植面積逐年擴(kuò)大，逐漸形成一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模。生產(chǎn)過(guò)程中為了防治枸杞螨蟲(chóng)等問(wèn)題，通常會(huì)使用殺螨劑。乙唑螨腈是新型吡唑類(lèi)殺螨劑[6-8]，通過(guò)代謝成羥基形式而活化產(chǎn)生活性，阻礙電子傳遞，從而破壞氧化磷酸化過(guò)程，具有觸殺作用，對(duì)柑橘全爪螨[9-10]、始葉螨、蔬菜朱砂葉螨、花卉二斑葉螨[11]、荔枝葉螨[12]、西瓜二斑葉螨[13-14]、琯溪蜜柚紅蜘蛛[15]等有較好的防治效果。在我國(guó)乙唑螨腈已在柑、橘、蘋(píng)果等果蔬上獲準(zhǔn)登記使用，并已制定了相關(guān)的最大殘留限量（MRL）[16]，但尚未制定檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于乙唑螨腈的檢測(cè)分析方法有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，并已在少量作物上進(jìn)行殘留動(dòng)態(tài)研究[17-21]，而在枸杞果實(shí)中乙唑螨腈檢測(cè)方法的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究建立了以乙腈為提取溶劑，經(jīng)N-丙基乙二胺（PSA）及石墨化碳黑（GCB）凈化，采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測(cè)定枸杞中乙唑螨腈的分析方法，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確。檢測(cè)枸杞中乙唑螨腈殘留，旨在為我國(guó)制定乙唑螨腈在枸杞中的農(nóng)藥最大殘留限量提供分析方法，對(duì)枸杞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

枸杞，品種為寧杞7號(hào)，采自寧夏農(nóng)林科學(xué)院園林場(chǎng)試驗(yàn)基地。取1 kg鮮果作為直接測(cè)試樣品，另取2 kg鮮果制干（采后的新鮮枸杞，經(jīng)2%的食用級(jí)碳酸鈉或碳酸氫鈉水溶液浸漬5～10 s脫蠟，瀝干后晾曬制干），作為枸杞干果試驗(yàn)樣品。

乙唑螨腈標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)1253429-01-4，純度99%），德國(guó)HPC公司；乙腈、甲醇（色譜純），美國(guó)默克試劑公司；氯化鈉（分析純，140℃烘烤4 h），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-丙基乙二胺吸附劑（40～63μm），石墨化碳黑（120～400目），美國(guó)安捷倫公司；水為去離子水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Thermo TSQ Quantum型超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)賽默飛公司；Heal Force Neofuge 18R型高速離心機(jī)，香港力康發(fā)展有限公司；MS3 digital型渦流混合器，德國(guó)IKA公司；PL202-L型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SMT-Y09型組織搗碎機(jī)，深圳斯瑪特智能電器發(fā)展有限公司；THZ-82A水浴恒溫振蕩器，金壇榮華儀器制造有限公司；超純水機(jī)、精密移液槍以及其他實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

將鮮、干枸杞樣品于-18℃冷凍冰箱中保存。試驗(yàn)時(shí)將鮮、干枸杞樣品取出，鮮樣用高速組織搗碎機(jī)打漿，干樣用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（可加少量的液氮）粉碎（30 g樣品粉碎時(shí)間為30 s），分別置于樣品瓶中，-18℃冷凍備用。

1.2.2 樣品的提取與凈化

分別稱(chēng)取枸杞鮮果10.00 g、干果5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，在水浴恒溫振蕩器中振蕩40 min，加入5.0 g氯化鈉，蓋上蓋子，振搖約1 min，放入離心機(jī)，于4 000 r/min離心5 min，吸取2 mL上清液于15 mL離心管中（提前稱(chēng)好50 mg PSA和10 mg GCB）渦旋凈化后過(guò)0.22μm濾膜，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1μL；流動(dòng)相梯度見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相洗脫條件Table 1 Fluid phase elution conditions

1.2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取1 mL 10 mg/L的乙唑螨腈標(biāo)準(zhǔn)工作液，在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，得到乙唑螨腈母離子[M]+（m/z394.1）。對(duì)母離子施加不同的碰撞能量，對(duì)產(chǎn)生的子離子進(jìn)行全掃描，得到相對(duì)豐度較高的乙唑螨腈子離子[M]+（m/z310.1）和[M]+（m/z254.0），質(zhì)譜條件為離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：正離子源；離子噴霧電壓：3.5 kV；毛細(xì)管傳輸溫度：300℃；碰撞壓力：0.199 5 Pa；鞘氣：30 arb；輔氣：10 arb；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。具體質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 乙唑螨腈的多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)分析參數(shù)Table 2 Multi-reactive ion monitoring and analysis parameters of cyetpyrafen

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Thermo Xcalibur Quan Browser軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

將乙唑螨腈標(biāo)準(zhǔn)品分別用乙腈溶解并定容，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再分別用乙腈稀釋配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆?。為了消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，使用枸杞空白樣品提取液再分別逐級(jí)稀釋為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在儀器條件下測(cè)定，濃度為0.1 mg/L乙唑螨腈標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1，出峰時(shí)間在6.30 min。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得出乙唑螨腈線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。在0.01～1.0 mg/L范圍內(nèi)，乙唑螨腈的進(jìn)樣質(zhì)量濃度（x）與色譜峰面積（y）間線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性方程y=1×107x+115 848，R2=0.999 3，定量限（LOQ）=0.01 mg/kg。

圖1 乙唑螨腈標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0.1 mg/L）LC-MS/MS的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.1 Multi-reaction monitoring chromatogram of cyetpyrafen standard solution(0.1 mg/L)using LC-MS/MS

圖2 乙唑螨腈標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Standard curve of cyetpyrafen

2.2 提取溶劑的選擇

提取溶劑應(yīng)與殘留分析的化合物有良好的溶解性和穩(wěn)定性，適于樣品制備和色譜分析，不僅要求目標(biāo)物被充分提取，而且提取的雜質(zhì)干擾越少越好。根據(jù)乙唑螨腈性質(zhì)，常用的提取劑有乙腈、甲醇和乙醚。在提取溶劑研究中，對(duì)比了3種提取溶劑對(duì)枸杞鮮、干樣品乙唑螨腈的提取效果，結(jié)果見(jiàn)圖3。通過(guò)在不同溶劑中的提取率試驗(yàn)及色譜掃描峰面積與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值的比較結(jié)果可知：用甲醇或乙醚提取枸杞樣品中的乙唑螨腈時(shí)，回收率均不能達(dá)到分析檢測(cè)的要求；而采用乙腈提取時(shí)，乙唑螨腈的平均回收率均在87.8%～97.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在5.5%～12.0%之間，完全能滿(mǎn)足分析檢測(cè)要求。因此，確定溶解性和穩(wěn)定性最好的乙腈作為枸杞鮮、干樣品的提取溶劑。同時(shí)，試驗(yàn)還進(jìn)行了不同提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響研究，結(jié)果表明，提取1次與提取2次、3次結(jié)果差異不大。從提取效率角度考慮，提取1次完全可以達(dá)到較好的效果，最終確定使用乙腈為提取溶劑，提取1次。

圖3 不同提取劑提取效果的研究Fig.3 Research on the extraction performance usingdifferent extractants

2.3 吸附劑的優(yōu)化

針對(duì)目前常用的色譜前處理方法固相萃?。⊿PE）、QuEChERS法，通過(guò)測(cè)定乙唑螨腈添加回收率，對(duì)各個(gè)方法進(jìn)行篩選。由圖4可見(jiàn)，固相萃取與QuEChERS法效果差異不顯著，從前處理效率考慮，固相萃取較QuEChERS法用時(shí)長(zhǎng)，從成本考慮，固相萃取較QuEChERS法費(fèi)用高，綜合后最終確定最佳前處理方法為采用QuEChERS方法處理，用乙腈提取，PSA和GCB凈化。

圖4 不同前處理方法效果的對(duì)比Fig.4 Comparisons of the effects of different pretreatment methods

分別考察了不同質(zhì)量的PSA對(duì)凈化效果和回收率的影響。由圖5可見(jiàn)，選用20、50、100 mg PSA，鮮果、干果2種基質(zhì)中乙唑螨腈的回收率分別為66.2%～86.1%、80.1%～103.0%和63.1%～80.2%。最終選用50 mg PSA加10 mg GCB。鑒于2種基質(zhì)中乙唑螨腈均滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，因此未進(jìn)一步研究基質(zhì)效應(yīng)的影響。

圖5 不同質(zhì)量PSA吸附劑對(duì)凈化效果的影響Fig.5 Influence of different weights of PSA adsorbents onpurification effect

2.4 回收率和精密度

在枸杞空白樣品中分別添加3個(gè)濃度水平（0.01、0.1、1.0 mg/kg）的乙唑螨腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)5次，按照上述方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。枸杞鮮果、干果中乙唑螨腈添加回收率在80.4%～105.6%，RSD在5.5%～12.0%，符合農(nóng)藥殘留被測(cè)組分為0.01～1.0 mg/kg時(shí)精密度為18%～22%的要求，該方法高效、快速，具有可行性。乙唑螨腈在枸杞鮮、干果空白及0.1 mg/L添加回收總離子流圖見(jiàn)圖6。

圖6 乙唑螨腈在枸杞鮮、干果上空白及添加色譜圖Fig.6 Chromatograms of fresh and dried Goji berries with and without the addition of cyetpyrafen

表3 枸杞（鮮果、干果）中乙唑螨腈添加回收率、精密度（n=5）Table 3 The recovery rate and accuracy of the addition of cyetpyrafen in Goji berries(fresh fruit,dried fruit)(n=5)

3 結(jié)論

本文采用QuEChERS方法處理，乙腈提取，PSA和GCB凈化，建立了枸杞鮮果、干果中乙唑螨腈殘留檢測(cè)方法，并對(duì)方法的回收率、精密度進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，使用該檢測(cè)方法乙唑螨腈農(nóng)藥在枸杞鮮果、干果中平均回收率為80.4%～105.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.5%～12.0%，定量限為0.01 mg/kg，方法的精密度和準(zhǔn)確性較好，符合農(nóng)殘分析的要求[22-23]，具有可行性。