曹景鑫 郝昕 李洋 李璐 張月 梁立巍楊顯良馬玲

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)(赤塔農業(yè)科技研究所，俄羅斯)(東北林業(yè)大學)

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)作為世界范圍針葉樹病害松材線蟲病的病原，是嚴重危險森林生態(tài)系統(tǒng)的病原物。松材線蟲不僅對許多國家的林業(yè)造成巨大損失，而且對森林生態(tài)系統(tǒng)造成極大的破壞[1-2]。2021年松材線蟲病在我國已傳播擴散至19個省(自治區(qū)、直轄市)742個縣級行政區(qū)，發(fā)生面積達1.72×106hm2，致死樹木1.41×107株，造成經(jīng)濟和生態(tài)價值的巨大損失[3-4]。

松材線蟲屬于遷移型植物內寄生線蟲，具有與其它植物寄生線蟲不同的取食策略，并通過這種獨特的取食策略實現(xiàn)在寄主體內繁殖與生存[5]。松材線蟲在侵染寄主初期，通過口針釋放多種效應因子到寄主體內，破壞寄主的防御體系，達到對寄主的入侵的目的[6]。效應因子(如β-1,4-內切葡聚糖酶基因[7]、果膠酸裂解酶[8]、磷酸酶等)與寄主間存在較為復雜的相互關系[9-10]，并且在降解寄主細胞壁、調控寄主植物細胞周期和抵抗寄主防御反應等方面具有重要作用。

磷酸酶作為病原物侵入寄主后分泌的效應因子，能夠改變寄主體內信號轉導物質的磷酸化狀態(tài)，增強病原致病性。如綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)侵染寄主昆蟲后，會分泌酸性磷酸酶來降解昆蟲血液中的有機磷，產(chǎn)生無機磷為自身繁殖和生長提供營養(yǎng)[11-13]；許多侵染動植物的革蘭氏陰性菌也會通過向寄主體內分泌磷酸酶，干擾寄主免疫反應并增強自身致病性[14]；秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)分泌的酸性磷酸酶也與胚胎發(fā)育和抗逆態(tài)的形成密切相關[15-16]；寄生在植物體內的線蟲分泌的磷酸酶在侵染寄主過程中發(fā)揮著重要作用(如南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)侵染寄主植物后，會分泌磷酸酶到寄主體內發(fā)揮消化作用，從而促進線蟲寄生[17]；禾谷孢囊線蟲(Heteroderaavenae)侵染寄主植物后會分泌酸性磷酸酶以促進對寄主的早期侵染[18])。

松材線蟲在對寄主的侵染過程中，實踐證明松材線蟲寄生基因和效應因子發(fā)揮著重要作用[19-23]，但是松材線蟲分泌的蛋白磷酸酶功能和作用尚未見報道。因此，本文選取松材線蟲酸性磷酸酶基因家族中成員較多的組氨酸酸性磷酸酶(HAP)基因家族開展研究。從生物信息學角度分析松材線蟲HAP基因家族，利用松材線蟲的基因組數(shù)據(jù)篩選松材線蟲HAP基因家族成員，通過生物信息工具對其進行理化性質、信號肽、跨膜結構域、系統(tǒng)發(fā)育、基因定位、基因結構與保守基序分析，以及分析松材線蟲接種黑松不同時期和被松樹代謝產(chǎn)物β-蒎烯[24]脅迫后的轉錄組數(shù)據(jù)，獲得松材線蟲HAP基因家族成員在不用處理下的基因表達譜，為進一步揭示HAP基因家族在松材線蟲侵染寄主過程中所發(fā)揮的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 松材線蟲HAP基因家族成員鑒定及理化性質

通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫獲取松材線蟲最新全基因組SAMEA7282713的相關數(shù)據(jù)。再通過NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫查詢并下載秀麗線蟲的HAP蛋白序列，利用該蛋白序列本地blast比對檢索松材線蟲蛋白數(shù)據(jù)庫，獲得松材線蟲HAP候選蛋白序列。登陸Pfam數(shù)據(jù)庫查詢并下載HAP所具有的保守結構His_Phos_1(PF00300)和His_Phos_2(PF00328)的隱馬爾可夫模型，利用HMMER3.0軟件在松材線蟲蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索具有以上兩個結構域的候選蛋白序列。在NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和Pfam(http://pfam.xfam.org/)上鑒定兩種方法所得候選蛋白序列是否具有His_Phos_1和His_Phos_2兩種保守結構域，刪除冗余序列，獲得松材線蟲HAP基因家族成員蛋白序列。利用在線軟件Expasy(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam)[25]，SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析松材線蟲HAP基因家族成員的理化性質，信號肽和跨膜結構域。

1.2 松材線蟲HAP基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為進一步了解松材線蟲HAP基因家族成員的進化關系，使用MEGA11.0軟件對36個秀麗線蟲和34個松材線蟲HAP蛋白序列進行CLUSTAL W多序列比對，依據(jù)多序列比對結果使用MEGA軟件計算最適模型(LG+G)，構建最大似然進化樹，Bootstrap檢驗1 000次。隨后通過iTOL在線網(wǎng)站(https://itol.embl.de/)對系統(tǒng)進化樹美化。

1.3 松材線蟲HAP基因家族染色體定位

根據(jù)松材線蟲基因結構注釋文件，使用TBtools軟件[26]的Gene Density Profile功能提取線蟲基因密度信息。再依據(jù)線蟲基因結構注釋文件和基因密度信息，使用TBtools的Gene Location Visualize from GTF/GFF功能繪制BxHAP基因在松材線蟲染色體上的分布情況。

1.4 松材線蟲HAP基因家族基因結構及保守基序

通過松材線蟲基因結構注釋文件提取松材線蟲HAP基因的外顯子/內含子結構，應用在線工具GSDS2.0(http://gsds.gao-lab.org/)對基因結構進行可視化。使用模因(MEME)(https://meme-suite.org/meme/tools/meme/)分析松材線蟲HAP基因家族成員的保守基序分布，基序參數(shù)值設為19，其它參數(shù)默認。

1.5 松材線蟲HAP基因家族在不同處理下的基因表達譜

根據(jù)松材線蟲接種3年生黑松幼苗的轉錄組數(shù)據(jù)(PRJNA397001)和被不同濃度β-蒎烯脅迫后的轉錄組數(shù)據(jù)(PRJNA640733)，獲得34個松材線蟲HAP基因在不同處理下的表達值(FPKMs)，使用R語言pheatmap軟件包對所得數(shù)據(jù)進行表達量標準化處理及熱圖繪制。

1.6 松材線蟲被不同松樹代謝產(chǎn)物脅迫后體內BxHAP基因表達定量分析

為驗證松材線蟲HAP基因家族成員與松樹代謝產(chǎn)物互作的能力，選用東北林業(yè)大學森林保護學科生物農藥與分子生物學實驗室的松材線蟲材料，使用質量濃度為0、200、400、600、800、1 000 mg/L的松樹代謝產(chǎn)物α-蒎烯(麥克林，上海)和β-蒎烯(麥克林，上海)處理50 條混合蟲齡的松材線蟲，每處理重復三組。統(tǒng)計代謝產(chǎn)物處理松材線蟲24 h后線蟲存活率變化情況，使用SPSS 26.0軟件計算致死中間濃度(LC50)。再使用LC50的α-蒎烯和β-蒎烯處理松材線蟲，提取松材線蟲總RNA。Primer Premier 6.0設計4個上調基因的熒光定量引物(見表1)。熒光定量使用2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒，反應體系為94 ℃預變性30 s；94 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40個循環(huán)；95 ℃變性1 min，55 ℃延伸30 s，95 ℃變性30 s。反應所得基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算，每個基因重復定量3次，使用GraphPad Prism 9軟件繪制松材線蟲基因表達量變化圖。

表1 實時熒光定量PCR引物

2 結果與分析

2.1 松材線蟲HAP基因家族成員鑒定及理化性質

由表2可知，經(jīng)過兩次檢索比對，以及NCBI-CDD和Pfam驗證保守結構域后，從松材線蟲基因組中鑒定出34個HAP基因家族成員，依據(jù)成員的保守結構域與染色體位置分布信息，將其命名為BxHAP1～BxHAP34。BxHAP基因所編碼蛋白大小的跨度較大，其中最小的是BxHAP6(212個氨基酸)，而最大的是BxHAP11(1447個氨基酸)。BxHAP蛋白的相對分子量介于24 322.84～165 183.69，相對分子量最低的是BxHAP7(24 322.84)，最高的仍是BxHAP11(165 183.69)。BxHAP蛋白的理論等電點為5.12～9.91，其中等電點最低的是BxHAP12(5.12)，最高的為BxHAP1(9.91)，大部分BxHAP蛋白富含酸性氨基酸，主要在酸性亞細胞環(huán)境發(fā)揮功能。因此，說明松材線蟲HAP基因家族的不同成員間理化性質差異較大，各成員在生物體中可能具有不同的功能。信號肽和跨膜結構域預測分析表明，具有信號肽和跨膜結構域的有BxHAP12、BxHAP13、BxHAP14、BxHAP15、BxHAP20、BxHAP22、BxHAP23、BxHAP26、BxHAP27、BxHAP29、BxHAP31和BxHAP33等12個成員，這些成員符合典型效應因子的條件[27]，而其它成員可能屬于非典型效應因子[28-29]。

表2 松材線蟲HAP基因家族成員理化性質

2.2 松材線蟲HAP基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖1可知，通過松材線蟲和秀麗線蟲HAP蛋白序列構建的系統(tǒng)進化樹，明確了松材線蟲HAP基因家族成員間的進化關系。根據(jù)進化樹聚類分析，將松材線蟲HAP和秀麗線蟲HAP基因家族共70個成員劃分為6個亞家族：第Ⅰ、Ⅳ亞族為具有His_Phos_1保守結構域的亞族，因兩者間親緣關系較遠，故分成兩個亞族。其中松材線蟲HAP基因家族第Ⅰ亞族有BxHAP1、BxHAP4和BxHAP9等3個成員，第Ⅳ亞族有BxHAP3、BxHAP5、BxHAP6、BxHAP7和BxHAP10等5個成員；秀麗線蟲HAP基因家族第Ⅰ亞族有CeHAP1和CeHAP2兩個成員，第Ⅳ亞族有CeHAP5、CeHAP6、CeHAP9和CeHAP10等4個成員。第Ⅱ亞族成員含有His_Phos_2、PPIP5K2_N和RimK等3個保守結構域，其中BxHAP11屬于松材線蟲HAP基因家族第Ⅱ亞族；CeHAP31和CeHAP32屬于秀麗線蟲HAP基因家族第Ⅱ亞族。第Ⅲ亞族成員含有6PF2K和His_Phos_1保守結構域，包含一個松材線蟲HAP基因家族成員BxHAP2和三個秀麗線蟲HAP基因家族成員CeHAP4、CeHAP7和CeHAP8。第Ⅴ亞族成員含有His_Phos_1或His_Phos_2保守結構域，其中BxHAP8、BxHAP17屬于松材線蟲HAP基因家族第Ⅴ亞族；CeHAP3、CeHAP11、CeHAP20、CeHAP34、CeHAP35和CeHAP36等屬于秀麗線蟲HAP基因家族第Ⅴ亞族。第Ⅵ亞族是最大的亞族，含有His_Phos_2保守結構域，其中松材線蟲HAP基因家族第Ⅵ亞族有BxHAP12、BxHAP13、BxHAP14、BxHAP15、BxHAP16、BxHAP18、BxHAP19、BxHAP20、BxHAP21、BxHAP22、BxHAP23、BxHAP24、BxHAP25、BxHAP26、BxHAP27、BxHAP28、BxHAP29、BxHAP30、BxHAP31、BxHAP32、BxHAP33、BxHAP34等22個成員；秀麗線蟲HAP基因家族第Ⅵ亞族有CeHAP12、CeHAP13、CeHAP14、CeHAP15、CeHAP16、CeHAP17、CeHAP18、CeHAP19、CeHAP21、CeHAP22、CeHAP23、CeHAP24、CeHAP25、CeHAP26、CeHAP27、CeHAP28、CeHAP29、CeHAP30、CeHAP33等18個成員。

2.3 松材線蟲HAP基因家族染色體定位

由圖2可知，松材線蟲HAP基因染色體定位圖闡述了BxHAP基因在染色體上的分布情況。根據(jù)BxHAP在松材線蟲染色體上的分布信息，34個BxHAP基因均勻分布在前6條染色體上。BxHAP1、BxHAP2和BxHAP11等3個BxHAP基因均勻分布第1條染色體；BxHAP3、BxHAP4、BxHAP12、BxHAP13、BxHAP14、BxHAP15、BxHAP16、BxHAP17和BxHAP18等9個BxHAP基因分布在第2條染色體上，其中BxHAP12～BxHAP15集中分布在染色體的頂端。BxHAP5、BxHAP6、BxHAP7、BxHAP19和BxHAP20等5個BxHAP基因集中分布在第3條染色體的中下部；BxHAP21、BxHAP22、BxHAP23、BxHAP24、BxHAP25、BxHAP26、BxHAP27等7個BxHAP基因集中分布在第4條染色體的下部；BxHAP8、BxHAP9、BxHAP28、BxHAP29、BxHAP30、BxHAP31和BxHAP32主要分布在第5條染色體的中下部，其中BxHAP29、BxHAP30和BxHAP31集中在染色體下部；BxHAP10、BxHAP3和BxHAP34等3個BxHAP基因均勻分布在第6條染色體上。表明34個BxHAP基因均勻分布在松材線蟲的6條染色體上，屬于松材線蟲的關鍵基因家族。

圖1 松材線蟲與秀麗線蟲HAP基因家族系統(tǒng)進化樹

2.4 松材線蟲HAP基因家族的基因結構及保守基序

由圖3可知，根據(jù)松材線蟲HAP基因家族基因結構，明確了松材線蟲HAP基因家族的內含子和外顯子的組成情況。34個BxHAP基因中，BxHAP6、BxHAP7、BxHAP20含有的外顯子數(shù)量最少，每基因僅含有3個外顯子，BxHAP11含有最多，每基因含有15個外顯子。BxHAP基因中擁有5個外顯子的最多，共有8個基因(BxHAP1、BxHAP3、BxHAP4、BxHAP8、BxHAP19、BxHAP25、BxHAP33和BxHAP34)；擁有7個外顯子的基因有BxHAP13、BxHAP22、BxHAP23、BxHAP26和BxHAP31；擁有6個外顯子的基因有BxHAP9、BxHAP12、BxHAP24和BxHAP29；擁有9個外顯子的基因由BxHAP2、BxHAP10、BxHAP14和BxHAP28。然后為擁有8個外顯子的基因有BxHAP18、BxHAP27與BxHAP30；擁有10個外顯子的基因有BxHAP15、BxHAP16和BxHAP3；擁有4、11、13個外顯子的基因分別是BxHAP5、BxHAP17和BxHAP21。表明松材線蟲HAP基因家族成員的功能在家族進化過程中具有較大分化。

圖2 松材線蟲HAP基因染色體定位圖

圖3 松材線蟲HAP基因家族基因結構

由圖4可知，34個松材線蟲HAP基因家族成員共含有19種保守基序，分別命名為Motif1～Motif19。34個成員均具有Motif2，以及除BxHAP10外都具有Motif3。BxHAP1～BxHAP10中，除BxHAP4外，僅具有Motif13，而沒有Motif1；BxHAP11～BxHAP34均僅具有Motif1，而沒有Motif13。其余Motif隨機分布于各成員中，且相同Motif在不同成員上排列順序近乎一致。利用NCBI-CDD和Pfam軟件對19種Motif進一步分析，發(fā)現(xiàn)不同成員的Motif2和Motif3均定位于His_Phos_1或His_Phos_2保守結構域中，Motif1定位于His_Phos_2保守結構域中，Motif13定位于His_Phos_1保守結構域中。結果進一步證實34個基因成員均屬于松材線蟲HAP基因家族，說明系統(tǒng)進化樹對松材線蟲HAP基因家族亞家族的劃分準確。

圖4 松材線蟲HAP基因家族保守基序結構圖

2.5 松材線蟲HAP基因家族在不同處理下的基因表達譜

由圖5可知。有4個BxHAP基因在接種黑松不同時期和被β-蒎烯脅迫后的松材線蟲體內均表現(xiàn)為上調表達，分別為BxHAP1、BxHAP5、BxHAP17和BxHAP20；有2個基因在接種黑松不同時期和被β-蒎烯脅迫后的松材線蟲體內均表現(xiàn)為下調表達，分別為BxHAP2和BxHAP21；有且僅有BxHAP8在接種黑松不同時期后的松材線蟲體內表達上調，卻在被β-蒎烯脅迫后的松材線蟲體內表達下調；有6個BxHAP基因在接種黑松不同時期后的松材線蟲體內表達下調，卻在被β-蒎烯脅迫后的松材線蟲體內表達上調，分別為BxHAP3、BxHAP18、BxHAP27、BxHAP30、BxHAP33和BxHAP34；其余21個BxHAP基因在兩種不同處理條件下，各階段表達趨勢各異。因此，大多數(shù)松材線蟲HAP基因家族成員在不同處理下表達趨勢均發(fā)生明顯改變，證明BxHAP基因在松材線蟲侵染松樹過程中發(fā)揮重要功能，同時證明該家族成員具有響應松樹代謝產(chǎn)物的能力，尤其是兩種處理條件下基因表達量均表現(xiàn)為上調表達的BxHAP1、BxHAP5、BxHAP17和BxHAP20等4個基因。

2.6 松材線蟲被不同松樹代謝產(chǎn)物脅迫后體內BxHAP基因表達定量分析

為進一步確認4個基因與松樹代謝產(chǎn)物之間的互作方式，選取不同質量濃度松樹代謝產(chǎn)物α-蒎烯和β-蒎烯脅迫松材線蟲。根據(jù)松材線蟲24 h后的存活率變化情況，統(tǒng)計得出α-蒎烯和β-蒎烯對松材線蟲的24 h致死的中間濃度(LC50)分別為854.284、797.919 mg/L。因此，β-蒎烯比α-蒎烯對松材線蟲有更高的殺線活性。

由表3可知，β-蒎烯處理松材線蟲后，線蟲體內4個BxHAP基因表達量均表現(xiàn)為顯著上調表達(p<0.05)；而α-蒎烯處理松材線蟲后，線蟲體內4個BxHAP基因出現(xiàn)不同的變化趨勢，BxHAP1表現(xiàn)為不顯著下調表達，BxHAP5表現(xiàn)為顯著上調表達(p<0.01)，BxHAP17表現(xiàn)為顯著下調表達(p<0.01)，BxHAP20表現(xiàn)為不顯著上調表達。因此，BxHAP基因確實具有響應松樹代謝產(chǎn)物的能力，且對不同松樹代謝產(chǎn)物具有不同的功能，其中，BxHAP5基因表達量在兩種處理條件下，松材線蟲體內均表現(xiàn)為顯著上調表達(p<0.01)，表明BxHAP5基因在松材線蟲抵抗松樹代謝產(chǎn)物的過程中發(fā)揮重要作用。

圖5 松材線蟲HAP基因在不同處理下的表達譜

表3 松材線蟲被不同松樹代謝產(chǎn)物脅迫后體內BxHAP基因表達情況

3 結論與討論

松材線蟲病自1982年傳入我國，對我國林業(yè)生態(tài)系統(tǒng)造成了極大的危害。松材線蟲與寄主間的互作關系因其所具有的隱蔽性特征而極為復雜[30-32]。因此，分析松材線蟲入侵寄主松樹并定殖的分子機制對于防治松材線蟲具有極為重要的意義。根結線蟲(Meloidogyne)[33]和孢囊線蟲[18]在侵染植物過程中會分泌磷酸酶破壞寄主防御體系，從而進入寄主體內建立寄生關系。

本文對松材線蟲HAP基因家族進行了鑒定和功能分析，共鑒定出34個松材線蟲HAP基因家族成員。松材線蟲HAP基因家族成員的氨基酸長度在212～1 447個氨基酸殘基間分布，相對分子量在24 322.84～165 183.69，多數(shù)成員為酸性蛋白；12個松材線蟲HAP基因家族成員為典型效應因子，其余成員可能為非典型效應因子；34個松材線蟲HAP基因家族成員分屬于6個不同的亞家族；松材線蟲HAP基因家族成員均勻分布在6條染色體上；各亞家族成員之間差異較大，但同亞家族的成員間具有相似的基因結構及保守基序，說明在線蟲進化過程中BxHAP基因發(fā)生了保留和丟失[34]。BxHAP基因在松材線蟲接種黑松不同時期和被松樹代謝產(chǎn)物β-蒎烯脅迫后的基因表達譜表明，松材線蟲HAP基因家族成員在松材線蟲侵染寄主過程中發(fā)揮重要功能，同時證明該家族成員能夠響應松樹代謝產(chǎn)物，尤其是被兩種處理后基因表達量均上調表達的BxHAP1、BxHAP5、BxHAP17和BxHAP20等4個基因。通過松材線蟲被不同松樹代謝產(chǎn)物脅迫后體內BxHAP基因表達定量分析，驗證了轉錄組數(shù)據(jù)分析的準確性，發(fā)現(xiàn)BxHAP基因針對不同松樹代謝產(chǎn)物時具有不同的功能，尤其是BxHAP5在兩種處理條件下均顯著上調表達，表明其是松材線蟲抵抗松樹代謝產(chǎn)物過程中的關鍵基因。綜上所述，本研究證實了松材線蟲HAP基因家族成員在松材線蟲侵染松樹過程中確實發(fā)揮著重要功能，能夠與松樹代謝產(chǎn)物相互作用，且針對不同的松樹代謝產(chǎn)物的作用方式不盡相同。同時發(fā)現(xiàn)并鑒定了松材線蟲抵抗松樹代謝產(chǎn)物過程中的關鍵基因BxHAP5，但其對松樹代謝產(chǎn)物的具體作用機理仍需要進一步探索與發(fā)現(xiàn)。