熊文濤，羅世友，沈雨民，熊煥金，吳小燕，肖葉青，陳明亮*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所，江西 南昌 330200；2.水稻國(guó)家工程研究中心(南昌)/國(guó)家水稻改良中心 南昌分中心，江西 南昌330200）

【研究意義】水稻是世界主要的糧食作物之一，是半數(shù)人口的主糧。低溫冷害是水稻常見(jiàn)的氣象災(zāi)害。在我國(guó)高緯度高海拔地區(qū)，在雙季稻區(qū)早稻的倒春寒和晚稻的寒露風(fēng)，均有不同程度的低溫冷害，嚴(yán)重影響了水稻的生長(zhǎng)發(fā)育[1]。在低溫脅迫下，水稻會(huì)產(chǎn)生一系列的生理代謝變化的應(yīng)激反應(yīng)，包括葉綠素含量的改變，植物內(nèi)源激素ABA 和GA 的改變，丙二醛、蔗糖、脯氨酸等代謝的積累等[2-3]。【前人研究進(jìn)展】水稻耐冷性也是由多種不同分子機(jī)制協(xié)調(diào)產(chǎn)生，是復(fù)雜的數(shù)量性狀（QTLs）。對(duì)水稻低溫脅迫分子生物學(xué)研究的逐步深入，定位及克隆的水稻耐冷相關(guān)遺傳位點(diǎn)和基因越來(lái)越多見(jiàn)報(bào)道[4-6]。GSZ2，編碼馬來(lái)酰乙酰乙酸異構(gòu)酶，第99位的苯丙氨酸的變異會(huì)導(dǎo)致酶活的下降，降低水稻耐冷性[7]。COLD1，編碼一個(gè)G 蛋白調(diào)節(jié)因子，在低溫響應(yīng)時(shí)與G 蛋白α 亞基RGA1 互作激活鈣通路，提高水稻耐冷性[8]。bZIP73，編碼一個(gè)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與bZIP71 互作調(diào)節(jié)脫落酸水平和活性氧平衡，提高水稻耐冷性[9]。Os-CNGC9，編碼環(huán)核苷酸離子通道蛋白，低溫下誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流，提高胞質(zhì)鈣含量，增強(qiáng)水稻的耐冷性[10]。HAN1，編碼細(xì)胞色素P450 家族的單加氧化酶，在MYB 轉(zhuǎn)錄因子的影響下調(diào)控茉莉酸介導(dǎo)的低溫響應(yīng)，是耐寒性的負(fù)調(diào)控因子[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】東鄉(xiāng)野生稻（簡(jiǎn)稱東野）被證明是具有較強(qiáng)耐冷性的水稻資源，目前已經(jīng)從中定位克隆了一些耐冷遺傳位點(diǎn)，但水稻耐冷性的分子調(diào)節(jié)機(jī)制較為復(fù)雜，還有大量相關(guān)研究需要進(jìn)一步開(kāi)展?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】前期研究從以東野為供體、贛香B 為受體的片段代換系中篩選獲得強(qiáng)耐冷株系IL732。通過(guò)對(duì)贛香B 和強(qiáng)耐冷株系IL732 冷脅迫處理前后進(jìn)行表達(dá)譜重測(cè)序，分析冷脅迫處理前后基因表達(dá)譜差異，通過(guò)生物信息學(xué)手段從中獲得多個(gè)耐冷相關(guān)候選基因[12]。其中LOC_Os11g19840，編碼一個(gè)類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶類似蛋白，命名為OsOMTL1（O-Methyltransferase like 1），進(jìn)行功能驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

贛香B 和以贛香B 為輪回親本，東野為供體親本的耐冷片段代換系IL732 為本研究室所有；OsOMTL1序列克隆自耐冷株系IL732，OsOMTL1的過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建、贛香B的轉(zhuǎn)化再生和陽(yáng)性篩選方法同熊文濤等P[13]轉(zhuǎn)化OsHI-XI。贛香B過(guò)表達(dá)OsOMTL1基因T1代陽(yáng)性植株用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 耐冷篩選

各水稻株系苗置于三洋MGC-450BP光照培養(yǎng)箱28 ℃恒溫培養(yǎng)至近3葉1心期時(shí)，放在常溫下3 d進(jìn)行煉苗，在澳柯瑪YC-370 醫(yī)用冷藏箱（8±1）℃低溫下處理3 d，隨后將試驗(yàn)材料置于常溫條件下使其恢復(fù)生長(zhǎng)。7 d后統(tǒng)計(jì)各株系的存活苗數(shù)。以幼苗存活率=存活苗數(shù)/處理前秧苗數(shù)×100%作為苗期耐冷性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選耐冷株系。

1.3 基因表達(dá)分析

贛香B和耐冷株系IL732培養(yǎng)至近3葉1心期時(shí)，放在常溫下3 d進(jìn)行煉苗，（8±1）℃低溫下處理3 d，取處理前和處理后的葉片進(jìn)行定量PCR 分析，以贛香B 常溫表達(dá)量為參照計(jì)算相對(duì)表達(dá)量；取IL732 常溫下3 葉1 心期不同部位根、莖、葉，以根部表達(dá)量為參照計(jì)算相對(duì)表達(dá)量；取贛香B 和轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)株系常溫下3 葉1 心期葉片，以贛香B 常溫為參照計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。定量PCR 引物為OsActin-F：5'-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3'；OsActin-R：5'-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3'；OsOMTL1-F：5'-CGCAAAGATGGAGGGAAGGT-3'，OsOMTL1-R：5'-GCCAGTCATTTTCGTCTCGC-3'；每個(gè)樣品檢測(cè)3次重復(fù)，每次隨機(jī)取5棵苗進(jìn)行混樣。

1.4 亞細(xì)胞定位

以耐冷株系IL732 cDNA 為模板擴(kuò)增OsOMTL1，前引物：5'-CTAGTCTTAAGTCCGGAGCTAGCTC TAGAATGGCAGGTCAGGCTCCCAA-3'；后引物：5'-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGATCCCGGATAGA CCTCAAAGACAGCT-3'，獲得目的片段用XbaI 與BamHI 雙酶切與瞬時(shí)表達(dá)載體PAN580-GFP 進(jìn)行重組，PCR測(cè)序驗(yàn)證后挑選陽(yáng)性克隆，與核標(biāo)記質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，弱光下培養(yǎng)8～10 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位。

1.5 基因分型作圖

登錄RiceVarmap 網(wǎng)站（http://ricevarmap2.ncpgr.cn），對(duì)OsOMTL1（LOC_Os11g19840）進(jìn)行SNP 分析，挑選其中具有非同義變異SNP對(duì)RiceVarmap網(wǎng)站中總計(jì)4 692份水稻種質(zhì)材料進(jìn)行單倍體分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因耐冷性驗(yàn)證

贛香B 和轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)OsOMTL1贛香的T1種子均發(fā)芽正常，但從葉片伸出開(kāi)始，過(guò)表達(dá)OsOMTL1株系生物量顯著低于贛香B，生長(zhǎng)受到抑制（圖1A）；表達(dá)量分析表明過(guò)表達(dá)株系中OsOMTL1的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于贛香B（圖1B）；苗期冷脅迫處理后，贛香B存活率為0%，而過(guò)表達(dá)OsOMTL1贛香株系存活率為26.3%，過(guò)表達(dá)株系耐冷性顯著強(qiáng)于贛香B（圖1C）。

圖1 過(guò)表達(dá)OsOMTL1植株耐冷鑒定Fig.1 Identification of cold tolerance of rice lines with overexpressing OsOMTL1

2.2 基因表達(dá)分析

對(duì)OsOMTL1進(jìn)行表達(dá)分析研究，該基因在3 d 低溫處理后表達(dá)量顯著上升，在耐冷株系IL732 中表達(dá)量常溫和低溫均顯著高于贛香B（圖2A）；該基因主要在葉片中表達(dá)，根部和莖里表達(dá)較低（圖2B）。原生質(zhì)體亞細(xì)胞定位表明該基因編碼蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中（圖2C）。

圖2 OsOMTL1表達(dá)模式研究Fig.2 Expression pattern of OsOMTL1

2.3 基因單倍型分析

通過(guò)OsOMTL1基因編碼區(qū)7 個(gè)非同義變異SNP 對(duì)RiceVarmap 網(wǎng)站中4 692 份水稻種質(zhì)材料進(jìn)行分析，OsOMTL1可以分為5 個(gè)基因單倍型，其中以I 型和II 型為主，存在明顯的秈粳分化（表1）。水稻亞種的分型分布表明粳稻主要在I 類單倍型中，而秈稻和Aus稻主要在II 和III 類單倍型中，IV 和V 類單倍型是稀有的類型（圖3）。序列檢測(cè)結(jié)果表明耐冷株系IL732 中OsOMTL1為I 類單倍型，與日本晴中該基因序列相同，而對(duì)照材料贛香B為II類單倍型。

圖3 不用水稻亞種OsOMTL1分型分布Fig.3 Genotyping distribution of OsOMTL1 with rice subspecies

表1 OsOMTL1基因單倍型分析Tab.1 Haplotype analysis of OsOMTL1

3 結(jié)論與討論

水稻耐冷性是受多種分子機(jī)制共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜性狀。保持葉綠體活力、維持電解質(zhì)平衡、提高抗氧化能力、積累可溶性小分子物質(zhì)、調(diào)節(jié)植物激素脫落酸和赤霉素含量等，都有助于提高水稻的耐冷性。其中，提高抗氧化能力是水稻對(duì)于低溫脅迫的重要防御機(jī)制。水稻在遭遇低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)氧代謝平衡失調(diào)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，造成細(xì)胞傷害。水稻通過(guò)產(chǎn)生各種抗氧化酶（超氧歧化酶SOD、過(guò)氧化氫酶CAT 等）和抗氧化劑（谷胱甘肽GSH、抗壞血酸AsA 等），清除活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞和組織[2,4]。類黃酮物質(zhì)是植物體內(nèi)重要的次生代謝物，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可以提高植物對(duì)于多種逆境脅迫的抗性，包括紫外線輻射、干旱脅迫、土壤鋁毒、生物病害等[14-16]。在低溫脅迫下，多種植物會(huì)積累類黃酮物質(zhì)，提高耐冷性[17-18]。擬南芥中過(guò)表達(dá)類黃酮代謝途徑中的黃酮醇合成酶FLS會(huì)促進(jìn)植株內(nèi)類黃酮物質(zhì)的積累，增強(qiáng)對(duì)于多種逆境脅迫的抗性[19]。本研究中通過(guò)低溫脅迫基因表達(dá)譜差異篩選克隆了來(lái)自東稻的冷誘導(dǎo)表達(dá)基因OsOMTL1，編碼一個(gè)類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶類似蛋白，可能參與了類黃酮物質(zhì)的合成。該基因在水稻耐冷株系IL732中表達(dá)量顯著高于冷敏感材料贛香B，且受到低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。該基因過(guò)表達(dá)水稻植株的苗期耐冷性顯著提高。有研究表明包括OsOMTL1在內(nèi)一些類黃酮類物質(zhì)相關(guān)代謝基因參與了水稻對(duì)于紫外輔射的響應(yīng)，表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)了類黃酮物質(zhì)的積累[20]。OsOMTL1可能通過(guò)參與水稻體內(nèi)類黃酮類物質(zhì)的代謝，增強(qiáng)了水稻植株的耐冷性。

植物生長(zhǎng)和抗逆反應(yīng)中存在著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)理，有研究表明植物逆境脅迫響應(yīng)反應(yīng)中類黃酮物質(zhì)的合成對(duì)于植物生長(zhǎng)具有抑制作用。BES1是擬南芥中油菜素甾體（BR）信號(hào)途徑上的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。正常環(huán)境下BR激活BES1，與多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子結(jié)合抑制它們的表達(dá)量，降低類黃酮物質(zhì)的生物合成，促進(jìn)植株生長(zhǎng)；當(dāng)逆境脅迫出現(xiàn)時(shí)，BES1的表達(dá)受到抑制，MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量上升，促進(jìn)類黃酮類物質(zhì)積累，抗逆性增強(qiáng)，但植株生長(zhǎng)受到顯著抑制[21]。當(dāng)木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶HCT基因被沉默后，在嚴(yán)重抑制植物生長(zhǎng)的同時(shí)會(huì)大量積累類黃酮物質(zhì)[22]。本研究表明，超表達(dá)OsOMTL1植株苗期雖然顯著提高了耐冷性，但生長(zhǎng)勢(shì)在正常條件下明顯弱于對(duì)照，可能與類黃酮類物質(zhì)合成和植物生長(zhǎng)之間的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制有關(guān)。

在長(zhǎng)期生長(zhǎng)環(huán)境篩選中，粳稻的耐冷性顯著強(qiáng)于秈稻。雖然目前已克隆水稻耐冷基因的分子機(jī)理有很大不同，但大多數(shù)基因核酸序列均存在典型的秈粳分型，且來(lái)自粳稻的基因型可以顯著提高耐冷性，如COLD1、HAN1、CTB4a等[8,11,23-24]。本研究中也存在類似的結(jié)果，OsOMTL1存在顯著的秈粳分型，克隆自耐冷株系IL732（來(lái)自東稻）的OsOMTL1屬于粳稻基因型，而對(duì)照冷敏感材料贛香B 屬于秈稻基因型。未來(lái)通過(guò)秈粳稻雜交、復(fù)交，人工低溫高壓篩選將粳稻中的耐冷種質(zhì)導(dǎo)入秈稻，是培育長(zhǎng)江中下游稻作區(qū)耐冷水稻的有效途徑。

致謝：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目（20181CBS004）同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！