劉龍博,鄭樹(shù)軒,鄭 潔

(1.淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,安徽淮北 253001;2.河南省農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校 夏邑分校,河南商丘 476400)

植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可避免地遭遇多種多樣的不良環(huán)境脅迫,其中低溫被認(rèn)為是限制植物生長(zhǎng)和地理分布的重要生態(tài)因素,也是影響農(nóng)作物與園藝植物生產(chǎn)的主要自然災(zāi)害。低溫脅迫可引起植物形態(tài)變化,并導(dǎo)致代謝紊亂,作物減產(chǎn),甚至死亡[1]。研究指出植物可通過(guò)調(diào)控一系列生理生化過(guò)程以適應(yīng)不利生長(zhǎng)環(huán)境,如冷馴化(Cold acclimation,CA)被認(rèn)為是溫帶植物提高耐寒性和安全越冬的重要策略[2]。CBF(C-repeat binding factors)又稱(chēng)DREB(dehydration-responsive element binding),是參與冷馴化的重要轉(zhuǎn)錄因子[3]。它能夠識(shí)別并結(jié)合至低溫應(yīng)答基因COR(cold-regulated)啟動(dòng)子區(qū)的CRT/DRE(G/ACCGAC)元件參與冷馴化過(guò)程[4]。模式植物擬南芥CBF1/DREB1C、CBF2/DREB1B、CBF3/DREB1A能夠迅速響應(yīng)低溫誘導(dǎo),進(jìn)而調(diào)控173個(gè)COR 參與低溫脅迫應(yīng)答[5]。過(guò)表達(dá)AtCBF1能夠顯著提高水稻、煙草、草莓、番茄和黃瓜低溫脅迫抗性[6],而CBF1和CBF3敲除后擬南芥低溫脅迫抗性降低約60%[7]。以上研究表明CBF 在植物低溫脅迫抗性調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要功能。

CBF屬于AP2轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)保守分支,除含有AP2結(jié)構(gòu)域外,在其上下游還分布有PKKPAGRx KFx ETRHP 和DSAWR 兩 個(gè) 特 征氨基酸序列。擬南芥CBF基因家族共6個(gè)成員,除CBF1～CBF3外,還 包 含 有CBF4/DREB1D、DREB1E/DDF2和DREB1F/DDF1[8]。 但AtCBF4、At DREB1E和At DREB1F主要參與ABA、干旱以及鹽漬脅迫響應(yīng),而并非低溫?；谌蚪M數(shù)據(jù),大量CBF基因家族成員已在多個(gè)植物物種中被廣泛研究并證實(shí)參與植物低溫脅迫響應(yīng),如:小麥(Triticum aestivum)[9]、油菜(Brassica rapa)[10-11]、蘋(píng) 果(Malus domestica)[12]、茶樹(shù)(Camellia sinensis)[13-14]、月季(Rosa chinensis)[15]等。然而有關(guān)石榴CBF基因家族的研究鮮有報(bào)道。

石榴(Punica granatumL.)起源于中亞地區(qū),經(jīng)由絲綢之路引入中國(guó),距今已有2 000多年栽培歷史。其果實(shí)外型美觀、口感鮮甜,含大量安石榴苷等鞣花單寧類(lèi)抗氧化活性物質(zhì),具備潛在保健和醫(yī)用價(jià)值[16]。石榴花期長(zhǎng)、樹(shù)姿美觀,兼具有觀賞價(jià)值,逐步被應(yīng)用在園林綠化。石榴業(yè)已成為一種價(jià)值較高的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。但石榴喜暖畏寒,在中國(guó)北方及黃淮石榴栽植片區(qū)冬春季氣溫較低,常有降溫霜凍甚至倒春寒等災(zāi)害性天氣,石榴易遭遇周期性?xún)龊?wèn)題,特別是以‘突尼斯’軟籽石榴為代表的軟籽系列品種耐寒性更差,不利于優(yōu)良品種推廣[17]。但目前石榴抗寒性研究主要集中在通過(guò)測(cè)定生理生化指標(biāo)比較不同石榴品種低溫脅迫抗性方面[17-18]?！蟊孔选┥郊t’‘突尼斯’基因組密碼的成功破譯,高質(zhì)量基因組圖譜的成功構(gòu)建,為進(jìn)一步系統(tǒng)開(kāi)展石榴分子生物學(xué)和遺傳改良奠定了研究基礎(chǔ)[16,19-20]。本研究從石榴全基因組中共鑒定到7個(gè)CBF 基因家族成員,基于生物信息學(xué)方法對(duì)PgCBFs基因家族成員氨基酸保守序列、染色體定位、理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、外顯子/內(nèi)含子排列、蛋白質(zhì)二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)、共線(xiàn)性關(guān)系、GO 注釋、啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件和表達(dá)模式等方面進(jìn)行綜合分析,為進(jìn)一步探索石榴CBF家族基因功能提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

‘突尼斯’軟籽石榴(Punica granatumL.‘Tunisia’)扦插苗種植于淮北師范大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)基地溫室內(nèi),溫度控制在26°C 左右,濕度為60%～70%,光照時(shí)間為白天14 h,夜間10 h,栽培基質(zhì)為泥炭土、珍珠巖和蛭石(體積比為3∶1∶2),低溫處理前每5 d澆水1次;采用上口徑和高分別為28 cm 與30 cm 的種植盆進(jìn)行栽種,每盆栽3株,每5盆為1次重復(fù)。試驗(yàn)所采用的石榴幼苗均生長(zhǎng)穩(wěn)定且長(zhǎng)勢(shì)一致,無(wú)病蟲(chóng)害。低溫處理時(shí)將石榴幼苗與種植盆共同放置于低溫冷藏柜中,處理溫度為-4℃,分別在處理后0、1、3、6、12、24 h收集幼嫩不定根和1 a生枝條韌皮部。每個(gè)樣品收集時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置3次重復(fù),樣品收集后置于液氮處理并儲(chǔ)存于-80 ℃低溫冰箱,待用。

1.2 石榴CBF基因家族成員鑒定

石榴基因組數(shù)據(jù)下載自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/? term=Punica+granatum)[20],擬南芥和水稻基因組數(shù)據(jù)分別來(lái)源于TAIR(http://www.arabidopsis.org)和RGAP(http://rice.uga.edu/)。使用7個(gè)擬南芥(Arabidopsis thaliana)和10 個(gè)水稻(Oryza sativa)CBF 蛋白序列通過(guò)本地Blast初步鑒定石榴CBF 候選基因(E＜1.00E-10)。在Pfam 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)中 下 載AP2結(jié)構(gòu)域(PF00847)種子文件,通過(guò)HMMER 3.1軟件鑒定含有AP2結(jié)構(gòu)域的候選基因家族成員(E＜1.00E-10)。提取Blast與HMMER 相同候選基因蛋白序列,利用SMART(http://smart.emblheidelberg.de)數(shù)據(jù)庫(kù)和Clustal W2(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)分析候選PgCBFs蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與CBF基因家族特征序列,確定石榴CBF 基因家族成員。

根據(jù)基因組注釋文件,通過(guò)TBtools軟件對(duì)PgCBF基因家族成員進(jìn)行染色體定位繪圖[21],并根據(jù)染色體定位信息對(duì)PgCBF 成員命名。PgCBF基因家族成員m RNA 和CDS 數(shù)據(jù)均來(lái)自于基因組注釋信息。通過(guò)Ex Pasy 在線(xiàn)網(wǎng)站(http://www.expasy.org/tools/)分析各成員的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、分子量和理論等電點(diǎn)。利用在線(xiàn)工具BUSCA(http://busca.biocomp.unibo.it/)對(duì)7個(gè)PgCBF成員亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

除石榴7個(gè)PgCBF基因家族成員外,收集擬南芥(A.thaliana)、水稻(O.sativa)、大豆(Glycine max)、番 茄(Solanum lycopersicum)、桃(Prunus persica)、蘋(píng)果(M.domestica)以及茶樹(shù)(C.sinensis)等7個(gè)物種的49個(gè)CBF 基因家族氨基酸序列,通過(guò)MEGA X 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。設(shè)定條件為:最優(yōu)替代模型使用JTT+ G,構(gòu)建方法使用最大似然法(Maximum Likelihood method,ML),Bootstrap設(shè)置為1 000重復(fù)。

1.4 石榴PgCBF基因結(jié)構(gòu)、保守基序和蛋白質(zhì)二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)7個(gè)物種的GFF3文件,提取50個(gè)CBF基因家族成員的基因序列、外顯子、內(nèi)含子以及上下游非翻譯區(qū)長(zhǎng)度與排布信息。通過(guò)Motif Elicitation(http://meme-suite.org/tools/meme)分析CBF基因家族成員的保守基序類(lèi)型,設(shè)置鑒定到MEME 數(shù)量為10 個(gè)。利用TBtools工具對(duì)CBF基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)和保守基序進(jìn)行可視化[21]。分別利用NPS@:SOPMA(https://www.predictprotein.org/signin)和Ex-PaSy Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org)預(yù)測(cè)PgCBF基因家族成員蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 CBF基因家族成員共線(xiàn)性分析

蘋(píng)果(M.domestica)和桃(P.persica)基因組數(shù)據(jù)下載自GDR(https://www.rosaceae.org/)。使用MCScan X 軟件對(duì)4 個(gè)物種的基因組序列進(jìn)行比對(duì),獲得它們的CBF基因家族共線(xiàn)性關(guān)系,使用TBtools繪制基因共線(xiàn)性結(jié)果[21]。

1.6 PgCBF基因家族成員GO 注釋分析

將石榴蛋白序列數(shù)據(jù)比對(duì)到Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù),利用TBtools 進(jìn)行蛋白序列GO 注釋分析[21]。

1.7 石榴PgCBFs基因家族啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

使用TBtools提取PgCBF 基因家族各成員起始密碼子(ATP)上游2 000 bp的堿基序列作為啟動(dòng)子區(qū)域,利用plantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順式作用元件分析。通過(guò)TBtools構(gòu)建熱圖呈現(xiàn)順勢(shì)作用元件分析結(jié)果[21]。

1.8 石榴PgCBFs基因家族轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

分別選取石榴根、葉片、花、內(nèi)種皮、外種皮和果皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析石榴PgCBF基因家族在不同組織中的表達(dá)模式。石榴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)(No.SRP100581)[19]。下載獲取轉(zhuǎn)錄組后,使用TBtools轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析系列功能,通過(guò)FastQC進(jìn)行質(zhì)控,利用Trimmomatic去除接頭,使用Kallisto對(duì)基因表達(dá)分析,通過(guò)TBtools繪制基因表達(dá)熱圖[21]。

1.9 RNA提取與石榴PgCBFs表達(dá)分析

使用RNA 提取試劑盒(TIANGEN,China)提取石榴根和枝條韌皮部總RNA,去除基因組DNA 后,合成cDNA,并使用DEPC水稀釋10倍用做qRT-PCR 模 板。QRT-PCR 使 用20μL 反應(yīng)體系,包含1μL cDNA 模板、0.5μL上和下游引物、10μL SYBR 預(yù)混液(cham Q SYBR qPCR Master Mix,Vazyme,China)以及8μL DEPC水。使用ABI 7300進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng),設(shè)定程序?yàn)?95 ℃5 min預(yù)變性;95 ℃5 s,60 ℃35 s,40個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)量使用Pg Actin作為內(nèi)參基因,通過(guò)2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[22]。本研究使用的引物信息見(jiàn)表1。

表1 石榴PgCBF基因qRT-PCR 引物Table 1 Primers used for qPCR assay of PgCBF genes in pomegranate

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴CBF基因家族成員鑒定與染色體定位分析

利用17個(gè)擬南芥和水稻CBF蛋白序列通過(guò)Blast以及HMM 方法,去除冗余序列后,在石榴基因組中鑒定到7 個(gè)CBF 候選基因家族成員。通過(guò)多序列比對(duì)(圖1),7個(gè)PgCBF 成員與擬南芥和水稻CBF 基因家族成員類(lèi)似,除AP2結(jié)構(gòu)域外,也包含有2個(gè)保守氨基酸序列(PKK/RPAGRx KFxETRHP和DSAWR),分別位于AP2結(jié)構(gòu)域上下游,表明鑒定到7個(gè)PgCBFs為石榴CBF基因家族成員。

圖1 擬南芥、水稻、石榴CBF家族基因蛋白質(zhì)多序列比對(duì)Fig.1 Multiple alignment of CBF protein from A.thaliana,O.sativa and P.granatum

根據(jù)PgCBF基因家族成員的染色體位置信息將它們命名為PgCBF1～PgCBF7(圖2-A)。7個(gè)成員分布在2 條染色體上,PgCBF1～PgCBF5集中分布在1號(hào)染色體下部,聚集在一起形成基因簇(圖2-B),PgCBF6和PgCBF7分別位于4號(hào)染色體的上部和下部。

圖2 石榴7個(gè)CBF基因染色體分布Fig.2 Distribution of seven CBF genes in pomegranate chromosome

2.2 石榴CBF基因家族成員序列理化性質(zhì)分析

如表2 所示,除PgCBF1和PgCBF3外,其余5個(gè)PgCBF m RNA 片段大小各不相同,長(zhǎng)度約為1 119～2 763 bp。PgCBF1、PgCBF3和PgCBF5編碼區(qū)(714 bp)和蛋白質(zhì)(238 aa)長(zhǎng)度一致,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量(MW)大小相近,PgCBF7與它們相似。7個(gè)成員理論等電點(diǎn)(pI)為4.89～5.60;亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)與轉(zhuǎn)錄因子蛋白功能定位一致,均處于細(xì)胞核內(nèi)。

表2 PgCBF基因家族成員理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physical and chemical properties of family members of PgCBF gene family

2.3 CBF基因家族進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

使用石榴等8個(gè)物種的56個(gè)CBF基因家族氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。將CBF 基因家族分為4個(gè)亞組,分別包含9、8、19和20個(gè)成員(圖3)。水稻除OsCBF2 外,其他9 個(gè)成員全部位于GroupⅠ,表明GroupⅠ中的CBF成員在單子葉植物中可能有獨(dú)特的作用[23]。與其他研究結(jié)果一致,擬南芥6 個(gè)成員分布于Group Ⅲ和Ⅳ中[23],PgCBF2、PgCBF4～PgCBF6與At-DREB1F和AtDREB1E具有較近的親緣關(guān)系,PgCBF7與AtCBF1～AtCBF4、MdCBF1、PpCBF6、SlCBF1、CsCBF3等 均 歸 屬 于GroupⅢ。PgCBF1和PgCBF3具有較近親緣關(guān)系,均歸屬于Group Ⅱ。

圖3 石榴與擬南芥、水稻、大豆、番茄、桃、蘋(píng)果及茶樹(shù)CBF基因家族進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of CBF gene family from pomegranate(Pg),Arabidopsis(At),rice(Os),soybean(Gm),tomato(Sl),peach(Pp),apple(Md)and tea(Cs)

2.4 CBF家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序及結(jié)構(gòu)域分析

為進(jìn)一步分析CBF基因家族進(jìn)化關(guān)系,綜合分析包括PgCBF 在內(nèi)的50個(gè)CBF 基因結(jié)構(gòu)和保守基序(圖4)。通過(guò)基因組GFF 注釋文件對(duì)CBF基因家族CDS分布以及外顯子和內(nèi)含子統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示大部分CBF成員基因結(jié)構(gòu)相似僅有1個(gè)外顯子,不包含內(nèi)含子,為內(nèi)含子缺失型(圖4-A)。僅有少部分成員含有1～2個(gè)內(nèi)含子,如:At DERB1E、PgCBF2、PgCBF4和PgCBF5。

通過(guò)MEME在線(xiàn)工具預(yù)測(cè)CBF基因家族成員的10個(gè)保守基序(圖4-B),各保守基序的氨基酸長(zhǎng)度為11～25 aa(表3)。除了少部分成員外,大多數(shù)CBF蛋白含有motif 1～7,且在不同CBF亞組中排列較為一致(圖4-B),表明這些motif在CBF家族成員高度保守。除與其他物種CBF成員基本一致的motif組合與排列順序外,7個(gè)PgCBF成員中有6個(gè)成員含有motif 9(圖4-B)。

表3 石榴和其他6個(gè)物種CBF蛋白保守基序分析Table 3 Analysis of conserved motif of CBF protein in pomegranate with other six species

圖4 CBF基因家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析Fig.4 Analysis of gene structure and conserved motif elements of CBF gene family

2.5 石榴CBF家族基因蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)7個(gè)石榴CBF 基因家族成員蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該家族包含α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲(表4)。在7個(gè)編碼蛋白中主要是α-螺旋(22.56% ～34.50%)和不規(guī)則卷曲(44.50%～59.02%),延伸鏈(9.05%～15.79%)和β-轉(zhuǎn)角(0.42%～5.50%)較少。

表4 石榴CBF基因家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 4 Secondary structure of protein sequence of CBF gene family in pomegranate

7個(gè)石榴CBF 基因家族成員蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與模型5wx9.1.A 較為相似(42.65%～46.58%)(圖5),且7個(gè)PgCBFs蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似,均由1個(gè)α-螺旋和2個(gè)β-折疊構(gòu)成。

圖5 7個(gè)石榴CBF基因家族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Tertiary structure of seven CBF proteins in pomegranate

2.6 石榴PgCBF基因共線(xiàn)性分析

如圖6所示,在石榴PgCBF家族間存在1個(gè)串聯(lián)復(fù)制基因?qū)?PgCBF4/PgCBF5)。并鑒定到石榴共與擬南芥、蘋(píng)果和桃的10個(gè)CBF 基因家族成員存在共線(xiàn)性關(guān)系。其中,PgCBF1分別與AtDREB1F、MdCBF4、MdCBF3和PpCBF1具有共線(xiàn)性關(guān)系;PgCBF2與At DREB1E具有共線(xiàn)性關(guān)系;PgCBF4與PpCBF3具有共線(xiàn)性關(guān)系;PgCBF6與MdCBF3以及PpCBF1具有共線(xiàn)性 關(guān) 系;PgCBF 7與MdCBF 1、MdCBF 2和PpCBF6具有共線(xiàn)性關(guān)系。

圖6 石榴、擬南芥、蘋(píng)果和桃的CBF基因家族共線(xiàn)性分析Fig.6 Synteny analysis of CBF genes family of P.granatum,A.thaliana,M.domestica and P.persica

2.7 石榴PgCBF基因GO 注釋

利用GO 注釋分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)PgCBF 可被劃分在分子功能、細(xì)胞組分、生物過(guò)程3 個(gè)大類(lèi)的26個(gè)亞類(lèi)中(圖7)。分子功能主要涉及順勢(shì)作用元件結(jié)合與轉(zhuǎn)錄調(diào)控(10個(gè)亞類(lèi)),細(xì)胞組分主要參與細(xì)胞核內(nèi)組分形成(1個(gè)亞類(lèi)),生物過(guò)程中涉及冷馴化(GO:0009631)、響應(yīng)低溫、高溫與環(huán)境脅迫刺激(GO:0050826、GO:0009408、GO:0006950、GO:0050896)、參與赤霉素、ABA 等激素合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程(GO:0009686、GO:0046885、GO:0009738、GO:0071215、GO:0010817、GO:0009737、GO:0009737、GO:0032870)。GO注釋表明7個(gè)PgCBF參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控與脅迫及植物激素刺激應(yīng)答,尤其是溫度脅迫。

圖7 石榴PgCBF基因家族成員GO 注釋分析Fig.7 Information from gene ontology(GO)annotation of PgCBFs

2.8 石榴PgCBF家族基因順式作用元件分析

位于上游啟動(dòng)子區(qū)的順勢(shì)作用元件是植物內(nèi)部信號(hào)和脅迫刺激響應(yīng)的重要調(diào)控區(qū)域。對(duì)7個(gè)石榴CBF基因家族起始密碼子上游2 kb堿基序列進(jìn)行分析。鑒定到一系列與脅迫相關(guān)(低溫、干旱、厭氧)、激素相關(guān)(ABA、MeJA、GA、SA、生長(zhǎng)素)以及光誘導(dǎo)相關(guān)順勢(shì)作用元件(圖8)。在脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子元件中,除PgCBF6外,6個(gè)成員含有16個(gè)厭氧誘導(dǎo)元件ARE;有5 成員含有6個(gè)低溫應(yīng)答元件LTR;4個(gè)成員含有7個(gè)干旱誘導(dǎo)元件MBS。在激素響應(yīng)元件中,在7個(gè)成員中鑒定到36個(gè)ABA 響應(yīng)元件ABRE,40個(gè)MeJA應(yīng)答元件CGTCA-motif和TGACG-motif,2 個(gè)GA 應(yīng)答元件P-box,7 個(gè)生長(zhǎng)素應(yīng)答元件Aux RR-core、TGA-element、TGA-box,5 個(gè)SA應(yīng)答元件TCA-element。在PgCBF 啟動(dòng)子區(qū)還存在大量光誘導(dǎo)元件,其中G-box 元件最多,共在7個(gè)成員共鑒定到40個(gè)。結(jié)果表明PgCBF參與響應(yīng)石榴脅迫應(yīng)答、激素和光誘導(dǎo)。

圖8 石榴CBF基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分析Fig.8 Analysis of putative cis-regulatory elements in promoter regions of CBF genes family in pomegranate

2.9 石榴PgCBF家族基因表達(dá)分析

通過(guò)石榴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19],在石榴根、葉片、花和果實(shí)不同組織中對(duì)7個(gè)PgCBF 成員的表達(dá)模式進(jìn)行分析(圖9)。結(jié)果顯示,除PgCBF6外,其余6個(gè)基因在根中顯著表達(dá),其中PgCBF5的表達(dá)量最高。PgCBF2和PgCBF5在花和果皮中表達(dá)顯著高于其余成員。PgCBF6僅在果皮中有顯著表達(dá)。與其他成員相比,PgCBF7在果實(shí)內(nèi)種皮和外種皮中表達(dá)上調(diào)。但所有PgCBFs在葉片中只有痕量表達(dá)或不表達(dá)。結(jié)果表明PgCBF 成員在不同組織中發(fā)揮功能存在差異。

圖9 PgCBFs在石榴不同組織中的表達(dá)熱圖Fig.9 Heatmap of expression level of PgCBFs in different tissues of pomegranate

在低溫處理后的石榴根和枝條韌皮部中PgCBF基因家族成員表達(dá)量均顯著上調(diào),但存在差異(圖10)。在根中,PgCBF1、PgCBF2、PgCBF4和PgCBF5在低溫處理后0～6 h表達(dá)量逐步升高并達(dá)到最大值,其中PgCBF2、PgCBF4和PgCBF5在6 h表達(dá)量均為0 h的10倍以上,而PgCBF1僅為0 h的2.2倍。在枝條韌 皮 部,PgCBF2、PgCBF3、PgCBF4和PgCBF5表達(dá)量均在處理后6 h 達(dá)到最高峰。PgCBF6在根和韌皮部表達(dá)趨勢(shì)一致,在處理24 h后達(dá)到最大值。PgCBF7在低溫處理1 h后表達(dá)量顯著升高并達(dá)到最大值,分別較0 h根和韌皮部升高35.3和23.3倍。在低溫處理12至24 h后,PgCBF7在根和韌皮部中仍顯著上調(diào),上調(diào)8.3～13.0倍,表明PgCBF7能夠快速響應(yīng)低溫誘導(dǎo)并持續(xù)應(yīng)答低溫脅迫。

圖10 低溫處理后PgCBF在石榴根和枝條韌皮部中的相對(duì)表達(dá)量Fig.10 Relative expression of PgCBF in pomegranate roots and phloem under low temperature treatment

3 討論

低溫是制約植物生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)主要非生物脅迫因子。植物遭受冷脅迫時(shí),約有12%的轉(zhuǎn)錄組基因參與CBF轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控過(guò)程,以增強(qiáng)植物耐寒能力[24]。隨著植物全基因組測(cè)序、組裝和注釋研究的進(jìn)一步發(fā)展,通過(guò)比較基因組方法在不同的植物物種中識(shí)別和鑒定到越來(lái)越多的CBF基因家族。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)CBF是一個(gè)小的基因家族,如在擬南芥(A.thaliana)、水稻(O.sativa)、油 菜(B.rapa)、大 豆(G.max)、蘋(píng) 果(M.domestica)、桃(P.persica)、梨(Pyrus bretschneideri)、葡萄(Vitis vinifera)[23]、鵝掌楸(Liriodendron chinense)[25]和茶樹(shù)(C.sinensis)[14]中分別鑒定到6、10、9、11、4、6、11、4、14和6個(gè)CBF成員。同樣的,本研究共在石榴全基因組中僅鑒定到7個(gè)CBF基因家族成員(表2),包含1個(gè)串聯(lián)復(fù)制基因?qū)?PgCBF4/PgCBF5)(圖6),但在染色體間未鑒定到片段重復(fù)(圖6),這可能是CBF家族成員較少的一個(gè)原因。鑒定到的7個(gè)PgCBF蛋白序列中均含有由59個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守AP2結(jié)構(gòu)域和2個(gè)特征序列(圖1),其中位于N 端的特征序列內(nèi)的PKK/RPAGRx KF屬于細(xì)胞核定位信號(hào)(nuclear localization signal,NLS)序列,表明PgCBF 定位在細(xì)胞核 內(nèi)(表2),與 棉 花 GhDREB1[26]、茄 子Sm CBF[27]、茶樹(shù)CsCBF[14]亞細(xì)胞定位分析結(jié)果一致。

構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)有利于分析基因家族成員蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能。與其他雙子葉植物CBF 成員分布一致(圖3)[23],PgCBF成員分布在GroupⅡ～Ⅳ。在石榴中,PgCBF2、PgCBF4、PgCBF5、PgCBF6與At DREB1F、At DREB1E共 同 歸 屬于Group Ⅳ,且均含有ABRE 順勢(shì)作用元件(圖8),推測(cè)它們可能參與ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或脅迫應(yīng)答過(guò)程(圖7)。在Group Ⅲ中多數(shù)成員能夠顯著響應(yīng)低溫脅迫,如:蘋(píng)果MdCBF1轉(zhuǎn)基因至擬南芥能夠顯著誘導(dǎo)AtCOR15a、AtRD29A和At RD29B表達(dá),低溫脅迫抗性明顯增強(qiáng)[12];PpCBF6在桃遭遇低溫脅迫時(shí)表達(dá)量顯著升高,能夠結(jié)合至Pp VIN2啟動(dòng)子區(qū)抑制其表達(dá),降低液泡轉(zhuǎn)化酶(vacuolar invertase,VIN)活性,提高蔗糖含量,從而緩解低溫對(duì)果實(shí)的傷害[28];在低溫脅迫條件下,番茄slcbf1突變體更易遭受低溫脅迫傷害,電導(dǎo)率和丙二醛含量明顯升高[29];茶樹(shù)CsCBF3在擬南芥中過(guò)表達(dá)后,能夠顯著誘導(dǎo)AtCOR15a和At RD29A表達(dá)上調(diào),明顯改善了轉(zhuǎn)基因植株在-4 ℃和-8 ℃的生長(zhǎng)狀態(tài)[14]。在石 榴 中,PgCBF7與MdCBF1、MdCBF2、PpCBF6均歸屬Group Ⅲ,并與它們存在共線(xiàn)性關(guān)系(圖6),GO 注釋(圖7)、LTR 順序作用元件(圖8)以及基因表達(dá)分析(圖10)等結(jié)果表明PgCBF7能夠直接并快速響應(yīng)低溫脅迫,其可能在低溫脅迫中發(fā)揮重要功能,但具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究說(shuō)明。

PgCBF基因家族成員與已鑒定到的大部分CBF基因家族成員平均蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、分子質(zhì)量均值類(lèi)似[14-15]。同時(shí),不同基因亞組在基因結(jié)構(gòu)和motif組成與排列上并沒(méi)有明顯的區(qū)分(圖4),PgCBF蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)似(表4,圖5),表明CBF基因家族在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守[13]。

一些轉(zhuǎn)錄因子已被證實(shí)能夠結(jié)合至CBF 啟動(dòng)子區(qū)參與其表達(dá)調(diào)控,如ICE1/2、CAMTA1-3、PIF4/7、EIN3、MYB15 等[15]。在石榴PgCBF啟動(dòng)子區(qū)鑒定到大量脅迫應(yīng)答、激素響應(yīng)與光誘導(dǎo)元件(圖8)。雖然PgCBF1和PgCBF6啟動(dòng)子區(qū)并未鑒定到LTR 元件,但在低溫處理誘導(dǎo)后顯著誘導(dǎo)表達(dá)量上升(圖10),表明在石榴中可能存在不依賴(lài)LTR 元件調(diào)控CBF表達(dá)途徑。如研究指出,PIF4/7與CBF1和CBF2基因啟動(dòng)子中的G-box結(jié)合后能夠在長(zhǎng)日照條件下抑制CBF1和CBF2表達(dá),而在短日照條件這種抑制可被解除,從而導(dǎo)致CBF表達(dá)上調(diào),增加耐寒性[30]。此外,CBF還參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。如外源Me-JA 處理能夠顯著誘導(dǎo)蘋(píng)果愈傷組織中Md-CBF1、MdCBF2、MdCBF3表達(dá),增強(qiáng)愈傷組織低溫抗性[31]。在敲除番茄slcbf1后,吲哚乙酸的含量明顯增加,但MeJA、ABA 和玉米素核苷的含量減少[29]。需要注意的是,雖然在7個(gè)啟動(dòng)子中共鑒定到36個(gè)ABRE元件(圖8),但研究發(fā)現(xiàn)ABA可直接結(jié)合至COR基因啟動(dòng)子區(qū)的ABRE元件,而提高植物耐寒性并不依賴(lài)CBF 途徑[32];然而,目前仍然缺少ABA與CBF基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)報(bào)道,但可能存在某些機(jī)制,它可以通過(guò)與其啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)CBF表達(dá)[33]。仍需要進(jìn)一步研究以闡明ABA和CBF基因之間的復(fù)雜調(diào)節(jié)關(guān)系。

本研究共在石榴基因組中鑒定到7 個(gè)CBF基因家族成員,它們的蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)相對(duì)保守;通過(guò)GO 注釋與順式作用元件分析,發(fā)現(xiàn)PgCBF基因家族與石榴激素和脅迫響應(yīng)緊密相關(guān),尤其在低溫條件下各基因表達(dá)均明顯上調(diào),特別是PgCBF7能夠快速響應(yīng)低溫誘導(dǎo)并持續(xù)高表達(dá),表明PgCBF7可能在石榴幼苗低溫脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)控功能。