馬 驥,朱文青,林俊泓,易華山,胡庭俊

(1.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530005;2.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,重慶榮昌 402460)

藍(lán)舌病病毒(Bluetounge virus,BTV)通過庫(kù)蠓傳播,感染以綿羊?yàn)槭椎亩喾N反芻動(dòng)物,引起藍(lán)舌病(Bluetounge,BT),患病動(dòng)物表現(xiàn)為口唇充血水腫、舌部發(fā)紺等[1-2]。BT 的流行對(duì)以歐洲為主的世界范圍內(nèi)的畜產(chǎn)品貿(mào)易造成嚴(yán)重影響,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World organization for animal health,OIE)將其列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病,中國(guó)也將其列為一類動(dòng)物疫病[3]。對(duì)BT 的預(yù)防主要通過接種滅活疫苗與弱毒疫苗[4]。BTV 目前已鑒定出至少29個(gè)血清型及其他的新型非典型性血清型,而各血清型之間較弱的交叉免疫反應(yīng)、隱性感染動(dòng)物和(或)感染動(dòng)物與疫苗免疫動(dòng)物的鑒別(Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA),仍然是BT 有效防控的巨大挑戰(zhàn)[4-7]。

BTV 是呼腸孤病毒科(Reoviridae),環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的雙鏈RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)病毒,病毒粒子為二十面體對(duì)稱的圓形無(wú)囊膜顆粒,由10條分節(jié)段的dsRNA 編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP7)和至少4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4、S10-ORF5)[8-9]。2011年,Belhouchet等[10]在BTV VP6的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)中發(fā)現(xiàn)BTV NS4的ORF。NS4含77到79個(gè)氨基酸殘基,其氨基酸序列在不同血清型中高度保守[11]。Belhouchet等[10]發(fā)現(xiàn)NS4 包裹于胞質(zhì)內(nèi)的脂滴周圍,還能保護(hù)dsDNA 不被脫氧核糖核酸酶Ⅰ降解;Ratinier等[12]發(fā)現(xiàn)NS4下調(diào)Ⅰ型干擾素與干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄水平以及多種啟動(dòng)子的活性,但不影響mRNA 的剪切;Li等[13]發(fā)現(xiàn)NS3與NS4協(xié)同作用,靶向Janus酪氨酸激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子(Janus tyrosine kinases-signal transducers and activators of transcription,JAKSTAT)通路中的STAT1,通過抑制其磷酸化,二聚化等抑制宿主天然免疫反應(yīng);筆者課題組的研究表明NS4 可能通過抑制干擾素通路上游的RIG-Ⅰ、MDA5、IRF9等基因抑制下游IFN-β以及ISGs等的表達(dá)。有鑒于NS4在調(diào)控宿主天然免疫信號(hào)通路中發(fā)揮的重要作用,本研究擬構(gòu)建BTVNS4基因原核表達(dá)載體,以期實(shí)現(xiàn)NS4蛋白的高效表達(dá),為進(jìn)一步研究NS4的免疫拮抗功能及基于NS4的診斷方法研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

E.coliBL21、藍(lán)舌病毒NS4基因p GEM-TNS4質(zhì)粒、pET-32a質(zhì)粒均由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)科學(xué)研究中心保存。

1.2 主要試劑與儀器

ExTaq酶、DL 5000 DNA Marker購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物有限公司;Axygen quick Gel Extraction Kit、Axy Prep質(zhì)粒DNA 小量試劑盒購(gòu)自吳江康寧生命科學(xué)有限公司;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoR Ⅰ、IPTG 購(gòu)自大連寶生生物有限公司;Trans T1 感受態(tài)細(xì)胞、氨芐西林(Ampicillin,Amp)購(gòu)自北京TransGen Biotech 公司;Beyo-ColorTM彩色預(yù)染蛋白Marker、考馬斯亮藍(lán)快速染色液、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗NS4 多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室自制并保存。其余所用試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。PCR儀、蛋白電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;超高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀FUSION FX-XT 購(gòu)自法國(guó)VILBER 公司。

1.3 BTV NS4 基因的擴(kuò)增

參照NCBI中Genbank 收錄NS4基因序列(AFV68249.1),利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成引物NS4 F 和NS4 R,在上、下游引物5′端分別添加BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。引 物NS4 F:5′-CGCGGATCCATGGTGAGGGGACACAACAGA-3′,NS4 R:5′-CGGAATTCCTACCCATCCTCCTCTGCTCG-3′,目的基因大小為246 bp,引物由北京華大基因科技有限公司合成。以p GEM-T-NS4質(zhì)粒為模板,NS4 F與NS4 R 為引物,PCR 擴(kuò)增NS4基因,反應(yīng)總體系為20μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變 性45 s,60 ℃退 火45 s,72 ℃延 伸1 min,35 個(gè) 循 環(huán);最 后72 ℃延 伸10 min,4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳分析正確后,用Axygen quick Gel Extraction Kit按步驟回收、純化目的基因片段。

1.4 p ET-32a-NS4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ內(nèi) 切 酶 將p ET-32a雙酶切,Solution Ⅰ16 ℃過夜連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans T1感受態(tài)細(xì)胞,LB 固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽(yáng)性單克隆菌落接種于含Amp的LB 液體培養(yǎng)基,37 ℃搖床培養(yǎng)。用Axy Prep 質(zhì)粒DNA 小量試劑盒提取質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切鑒定正確后,送至華大基因重慶公司測(cè)序,將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為p ET-32a-NS4。

1.5 IPTG 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的探索

將p ET-32a-NS4接種至含Amp的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃搖床過夜培養(yǎng)后,按照1∶1 000的比例接種至含Amp的液體培養(yǎng)基,37 ℃搖床培養(yǎng),在1 h、2 h、2.5 h、3 h時(shí)分別取菌液,以相同培養(yǎng)液為陰性對(duì)照,測(cè)定OD 值直至0.6～0.8。取OD 值0.6～0.8的菌液1 m L作空白對(duì)照,其余加入終濃度為0.6 mmol/L 的IPTG 溶液,37 ℃搖床培養(yǎng),分別在1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時(shí)采樣,樣品3 000 r/min離心2 min,棄大部分上清液后加入5×蛋白上樣buffer混勻,沸水浴8 min后高速離心。配制12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠和5%濃縮膠,上樣后60 V跑濃縮膠,120 V 跑分離膠。電泳結(jié)束后將膠用清水振蕩洗滌兩次,每次5 min,再加入考馬斯亮藍(lán)染色液染色25 min后,振蕩洗滌直至水澄清,凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.6 IPTG 最佳誘導(dǎo)濃度的探索

按“1.5”所述方法培養(yǎng)細(xì)菌,當(dāng)OD 值為0.6～0.8時(shí),取1 m L菌液作為空白對(duì)照,其余分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG 溶液,37℃搖床培養(yǎng),分別在4、6、8 h時(shí)取樣,按“1.5”所述方法進(jìn)行SDS-PAGE。

1.7 重組蛋白表達(dá)形式的探索

將OD 值為0.6～0.8 的菌液,以“1.5”與“1.6”測(cè)定的最佳誘導(dǎo)濃度與誘導(dǎo)時(shí)間加入IPTG,取樣。將樣品以3 000 r/min離心5 min,去掉上清,沉淀用PBS洗滌兩次,3 000 r/min離心2 min,PBS再洗滌沉淀兩次,加入適量的PBS混勻后,超聲破碎。破碎后12 000 r/min離心10 min,分離上清、沉淀,以PBS稀釋沉淀至體積與上清相同,加入5×蛋白上樣緩沖液,沸水浴8 min后,進(jìn)行SDS-PAGE。

1.8 可溶性蛋白表達(dá)可能性的探索

活化細(xì)菌,接種至含Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床培養(yǎng)2～3 h,當(dāng)OD 值為0.6～0.8時(shí),加入0.8 mmol/L IPTG,16 ℃搖床誘導(dǎo)過夜后,按“1.7”所述方法處理樣品,SDS-PAGE分析。

1.9 重組蛋白的Western-blot鑒定

將表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜,碎冰中200 m A 恒流轉(zhuǎn)膜40 min,加入封閉液4 ℃封閉過夜。NS4 兔抗多克隆抗體(一抗)1∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜,PBST 洗6 次,辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(二抗)以1∶3 000比例稀釋,室溫孵育1 h,PBST 洗6次,顯影,使用超高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀FUSION FX-XT 分析重組蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

連接目的基因片段與p ET-32a載體,轉(zhuǎn)化培養(yǎng),挑取單菌落經(jīng)PCR 檢驗(yàn),結(jié)果如圖1所示,提取質(zhì)粒經(jīng)酶切檢測(cè),結(jié)果如圖2所示。

圖1 pET-32a-NS4 重組質(zhì)粒PCR 鑒定圖Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid pET-32a-NS4

圖2 pET-32a-NS4 酶切電泳檢測(cè)Fig.2 Electrophoretic detection of restriction digestion of plasmid pET-32a-NS4

2.2 IPTG 最佳誘導(dǎo)時(shí)間

結(jié)果如圖3所示,重組蛋白大小為27 ku。在誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)量最大,8 h時(shí)無(wú)明顯增加,10 h、12 h的表達(dá)量減少,因此IPTG 的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。為減少試驗(yàn)結(jié)果的偶然性,后續(xù)對(duì)IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的探索將于4 h、6 h、8 h分別取樣。

圖3 0.6 mmol/L濃度IPTG 誘導(dǎo)不同時(shí)間重組蛋白表達(dá)量Fig.3 Expression index of recombined protein in induced by IPTG at different times with concentration of 0.6 mmol/L

2.3 IPTG 最佳誘導(dǎo)濃度

結(jié)果如圖4所示,IPTG 濃度0.8 mmol/L時(shí)表達(dá)量最高,濃度1.0 mmol/L表達(dá)量減少,因此最佳濃度為0.8 mmol/L。

圖4 不同IPTG 濃度誘導(dǎo)6 h表達(dá)產(chǎn)物分析Fig.4 Analysis of expression products induced by different IPTG concentrations for 6 h

2.4 重組蛋白表達(dá)形式與可溶性蛋白表達(dá)可能性

結(jié)果如圖5所示,沉淀組中有明顯的條帶,而上清液中的條帶較弱,說(shuō)明誘導(dǎo)的蛋白大部分位于沉淀中,以包涵體形式表達(dá)。將菌液以最佳誘導(dǎo)條件4℃搖床過夜培養(yǎng)后,結(jié)果如圖6所示,可溶性蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯改變,表明重組蛋白依然以包涵體形式表達(dá)。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析結(jié)果Fig.5 Analysis results of solubility in expression products

圖6 16 ℃上清中可溶性蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.6 Expression result of soluble protein in supernatant at 16 ℃

2.5 重組蛋白的Western-blot分析

結(jié)果如圖7所示,在27 ku可見目的條帶,與預(yù)期大小一致,表明重組蛋白能與NS4多克隆抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)。

圖7 表達(dá)產(chǎn)物Western blot分析Fig.7 Western blot analysis of expression products

3 討論

NS4在BTV 感染后2 h即可在胞質(zhì)中被檢測(cè)到,感染后24 h在胞質(zhì)與胞核內(nèi)形成小點(diǎn)狀聚集,通過核纖維蛋白與核仁標(biāo)記物B23共定位于核仁,感染后72 h 出現(xiàn)于胞膜[10-11]。此外,NS4能保護(hù)dsDNA 不被脫氧核糖核酸酶Ⅰ降解,但缺乏dsRNA 結(jié)合域而無(wú)法保護(hù)dsRNA 被RNAseⅢ降解[10]。研究表明,NS4在IFN 預(yù)處理的細(xì)胞中可促進(jìn)BTV-8的CPE 與復(fù)制,是胞內(nèi)干擾素通路的拮抗劑與毒力因子,顯著降低IFN-β與ISGs等轉(zhuǎn)錄水平以及與天然免疫相關(guān)的IRSE等啟動(dòng)子活性;且能與NS3共同作用于STAT1的SH2結(jié)構(gòu)域,抑制其磷酸化、核易位以及與STAT2 的作用從而抑制JAK-STAT 通路下游基因的激活[11-12,13]。綜上所述,NS4作為藍(lán)舌病病毒發(fā)現(xiàn)的新型非結(jié)構(gòu)蛋白之一,在BTV復(fù)制與拮抗宿主天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,因此,對(duì)NS4蛋白的深入研究具有重要意義,可能為闡明BTV 的致病機(jī)制提供新的方向。

基于BTV NS4在病毒復(fù)制及拮抗宿主天然免疫應(yīng)答中的重要作用,在本研究中,筆者構(gòu)建了BTVNS4基因原核表達(dá)載體,并對(duì)其在大腸桿菌BL21中以IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件進(jìn)行了分析與探索。韓珊等[14]對(duì)超氧化物歧化酶在大腸桿菌BL21 中誘導(dǎo)的最適IPTG 濃度為0.4 mmol/L;Carmignotto等[15]對(duì)重組Cas9 蛋白在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)的最適IPTG 濃度為0.5 mmol/L;榮娜等[16]對(duì)重組嗜水氣單胞菌外膜蛋白P5在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)的最適IPTG 濃度為0.5 mmol/L;Aghaiypour等[17]對(duì)重組破傷風(fēng)毒素C 蛋白在大腸桿菌BL21 中誘導(dǎo)的最適IPTG 濃度為1.0 mmol/L,有鑒于上述研究,本研究首先在0.6 mmol/L IPTG 誘導(dǎo),得到最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6 h;再設(shè)置IPTG 誘導(dǎo)濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 組,得到最佳誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L 后,再次分別進(jìn)行4 h、6 h、8 h時(shí)取樣檢測(cè)以驗(yàn)證,確保結(jié)果真實(shí)可靠,且保證重組蛋白表達(dá)量達(dá)到最大的前提下,選擇合適的IPTG 誘導(dǎo)濃度與時(shí)間。而Belhouchet構(gòu)建p GEX-BTV NS4重組質(zhì)粒,使用0.5 mmol/L的IPTG 在37 ℃誘導(dǎo)4 h或在28℃誘導(dǎo)8 h,這可能與所使用的構(gòu)建載體不同有關(guān)[10]。

研究表明,誘導(dǎo)溫度有利于蛋白合成的速度,但也增加了無(wú)活性蛋白集聚物的疏水作用而使得到的重組蛋白在大腸桿菌中易形成不溶性蛋白聚集體,即包涵體[18]。低溫誘導(dǎo)時(shí)有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊,從而形成可溶性蛋白[19]。本研究中,p ET-32a-NS4原核表達(dá)載體37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá),16 ℃時(shí)可溶性蛋白含量較低無(wú)法滿足試驗(yàn)需求。Belhouchet構(gòu)建的p GEX-BTV NS4在大腸桿菌BL21中同樣以包涵體形式存在,但p MAL-c5x-NS4載體在大腸桿菌中表達(dá)可溶性的NS4 重組蛋白[10,20]。本研究構(gòu)建的p ET-32a-NS4原核表達(dá)載體可獲得大量的NS4 重組蛋白,Western-blot分析表明,該重組蛋白能與NS4蛋白的兔多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。研究表明,包涵體蛋白經(jīng)變性、復(fù)性等方法重新折疊,得到可溶性的蛋白,以使該蛋白能夠得到更高效的應(yīng)用[21-22]。本研究中表達(dá)的NS4重組蛋白為后續(xù)BTV 拮抗宿主天然免疫反應(yīng)中作用機(jī)制研究提供基礎(chǔ)材料。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建藍(lán)舌病病毒NS4基因p ET-32a-NS4原核表達(dá)載體;p ET-32a-NS4在大腸桿菌BL21 中IPTG 的最佳誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間為6 h;重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá),為進(jìn)一步研究NS4功能提供材料。