王 斌,趙 利,侯靜靜

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所,蘭州 730070)

胡麻,也叫油用亞麻,是中國西北和華北地區(qū)重要的油料作物之一。亞麻籽中含有的木酚素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、膳食纖維和微量營養(yǎng)元素,亞麻籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸,具有預(yù)防和治療心腦血管、糖尿病,提高免疫力、抗癌和抗氧化等生理功能,具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健功能[1]。2019年中國亞麻種植面積23.3 萬hm2,亞麻總產(chǎn)量為34萬t,但進(jìn)口的亞麻籽總量達(dá)到42.7萬t,亞麻籽進(jìn)口量已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過國內(nèi)產(chǎn)量[2]。隨著人們健康意識(shí)的提高,對(duì)亞麻籽功能活性成分在營養(yǎng)保健和醫(yī)藥等領(lǐng)域的深入研究,胡麻籽的市場需求會(huì)持續(xù)增長。亞麻主要種植在高寒干旱地區(qū),產(chǎn)量低,農(nóng)民種植積極性不高。應(yīng)該針對(duì)不同用途選育適合深加工的優(yōu)良品種,增加其經(jīng)濟(jì)附加值。但是胡麻種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)狹窄,國內(nèi)胡麻育種長期使用骨干親本使得品種遺傳多樣性較低,品種選育難以取得較大的突破[3]。

通過化學(xué)劑誘導(dǎo)作物可以產(chǎn)生大量變異性狀,比常規(guī)雜交育種效率高,選擇生產(chǎn)上可利用的性狀和基因,具有獨(dú)特的優(yōu)勢。EMS(Ethyl methane sulfonate,甲基磺酸乙酯)是一種高效、穩(wěn)定和良好的化學(xué)誘變劑,誘變效果好,目前在花生[4]、大豆[5]、油菜[6]等油料作物上廣泛應(yīng)用。EMS化學(xué)誘變通常誘發(fā)C/G 到T/A 轉(zhuǎn)換的點(diǎn)突變,主要是將DNA 鳥嘌呤的N7 位置烷基化[7],出現(xiàn)鳥嘌呤N7 烷基活化,糖苷鍵斷裂脫去鳥嘌呤,導(dǎo)致基因復(fù)制時(shí)堿基錯(cuò)位,產(chǎn)生突變,或者是烷基化的鳥嘌呤和胸腺嘧啶配對(duì),產(chǎn)生突變,最終引發(fā)基因突變。EMS具有誘變效率高、材料損傷較小及適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。利用EMS 誘變構(gòu)建突變體庫已成為獲得突變體、創(chuàng)新種質(zhì)和育種的有效手段[8]。于瑩等[9]在亞麻上研究表明,高濃度EMS誘變亞麻成苗率較高,但大多數(shù)是不育植株,導(dǎo)致種子產(chǎn)量較低。EMS 誘變?cè)诤榈膱?bào)道較少,本研究設(shè)置不同誘變濃度和時(shí)間,探討EMS誘變對(duì)不同基因型胡麻品種的誘變效應(yīng),并對(duì)M3種子的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀進(jìn)行分析,為胡麻新品種選育和遺傳改良提供優(yōu)異資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試驗(yàn)的胡麻品種為‘輪選3 號(hào)’‘CDC SoRel’‘張亞2號(hào)’‘C9625’和‘內(nèi)亞6號(hào)’共5個(gè)品種,其中‘輪選3號(hào)’‘CDC SoRel’‘C9625’籽粒顏色為褐色,‘張亞2號(hào)’和‘內(nèi)亞6號(hào)’籽粒顏色為淺黃色,由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

1.2 主要試劑及藥品配置

化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS),購自Sigma公司。配置0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液,然后調(diào)試p H 至7.0。將磷酸鹽緩沖液作為溶劑,配制0(CK)、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%和1.5%的EMS溶液(V/V),現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理

試驗(yàn)設(shè)5個(gè)品種(A)、4個(gè)處理時(shí)間(B)、和5個(gè)誘變濃度(C),因素及水平如表1 所示。試驗(yàn)共20個(gè)處理,以磷酸鹽緩沖液為對(duì)照(CK)。每份材料選取飽滿種子1 000粒置于培養(yǎng)皿中,在通風(fēng)櫥中按不同處理進(jìn)行浸種,然后用無菌水沖洗種子10次。上述處理后得到的種子為M0,將M0種子30粒于雙層濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽,統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

表1 試驗(yàn)因素與水平Table 1 Experiments factors and levels

M0種子于2017年播種于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州試驗(yàn)地,每個(gè)處理種兩行,行長2 m,每行播種300粒。田間調(diào)查出苗期,出苗后分2次調(diào)查并(間隔1 周)統(tǒng)計(jì)出苗率。M1 種子于2018年在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州試驗(yàn)地按單株編號(hào)的順序全部播種;M2種子當(dāng)年進(jìn)行南繁加代,按編號(hào)每個(gè)材料種1 行。M3 種子于2019 年在甘肅省景泰縣按行播種,每個(gè)處理取20株進(jìn)行考種,考察株高、工藝長度、分莖數(shù)、分枝數(shù)、單株果數(shù)、千粒質(zhì)量、單株產(chǎn)量;利用瑞士Perten公司生產(chǎn)的DA 7200型近紅外品質(zhì)分析儀,進(jìn)行品質(zhì)成分分析,測定指標(biāo)包括粗脂肪含量、脂肪酸組分(主要為棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油酸)和木酚素含量。

發(fā)芽率=第7天發(fā)芽的種子數(shù)/總種子數(shù)×100%

出苗率=出苗數(shù)/播種的種子數(shù)×100%

相對(duì)出苗率=出苗率/對(duì)照的出苗率×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和DPS 7.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析方法,對(duì)胡麻不同處理的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS處理對(duì)不同基因型胡麻種子發(fā)芽率的影響

由圖1 可見,隨著EMS 處理濃度的增加和時(shí)間的延長,‘輪選3號(hào)’發(fā)芽率由最高93.33%降到最低51.11%,‘CDC SoRel’和‘C9625’由最高91.11%降到最低71.67%和72.22%,‘內(nèi)亞6號(hào)’由最高85.56%降到最低37.38%,‘張亞2號(hào)’由最高67.78%降到最低4.44%,變化趨勢基本都是由高到低。在不同品種間,尤其是不同籽粒顏色的品種間,EMS處理對(duì)發(fā)芽率的影響存在顯著差異。對(duì)籽粒顏色褐色的品種‘輪選3 號(hào)’‘CDC So Rel’‘C9625’發(fā)芽率影響,在不同濃度和時(shí)間處理下,發(fā)芽率呈緩慢下降趨勢,而對(duì)淺黃色品種‘張亞2號(hào)’和‘內(nèi)亞6號(hào)’的發(fā)芽率影響,呈快速下降趨勢?！畯垇? 號(hào)’對(duì)EMS 處理最敏感,其次是‘內(nèi)亞6號(hào)’,‘輪選3號(hào)’最不敏感。

圖1 EMS處理不同基因型胡麻種子發(fā)芽率Fig.1 Seed germination rate of different flax varieties under EMS treatment

2.2 EMS處理對(duì)不同基因型胡麻相對(duì)出苗率的影響

EMS誘變劑損傷種子活力,抑制萌發(fā);處理時(shí)間越長,誘變濃度越高,相對(duì)田間出苗率越低;同一濃度水平上處理時(shí)間越長,同一時(shí)間水平上誘變濃度越高,田間相對(duì)出苗率越低(表2)。EMS處理對(duì)不同品種相對(duì)出苗率的影響存在顯著差異,在不同品種間、不同處理時(shí)間和不同處理濃度下均呈顯著差異(P＜0.05)(表2)。不同品種間,‘輪選3號(hào)’相對(duì)出苗率高于其他品種,其次是‘CDC So Rel’和‘C9625’,而‘內(nèi)亞6號(hào)’‘張亞2號(hào)’相對(duì)出苗率最差?！瓹DC So Rel’和‘C9625’在處理B3C4、B3C5、B4C4、B4C5基本沒有出苗,而敏感品種‘張亞2號(hào)’‘內(nèi)亞6號(hào)’在濃度較高和 處理時(shí)間較長的情況下,基本沒有出苗。

表2 EMS處理不同基因型胡麻品種相對(duì)出苗率Table 2 Relative emergence rate of different flax varieties under EMS treatment

為了研究不同基因型胡麻品種、EMS處理時(shí)間和濃度3因素對(duì)胡麻相對(duì)出苗率的影響,進(jìn)行了方差分析和多重比較。由表2可知,品種、處理時(shí)間、濃度、品種×?xí)r間、品種×濃度、時(shí)間×濃度、品種×?xí)r間×濃度的F 值均達(dá)到顯著水平(P＜0.01),說明每個(gè)因素對(duì)相對(duì)出苗率的影響都是顯著的,不同品種、濃度和時(shí)間存在交互作用。而不同基因型的品種,在同樣的濃度和時(shí)間水平下出苗率也是顯著變化的?？梢?不同基因型的胡麻品種對(duì)EMS誘變的響應(yīng)是不同的。從平方和占比可知,對(duì)相對(duì)出苗率影響最大的因素是品種,其次是處理濃度和處理時(shí)間。

2.3 EMS處理對(duì)M3農(nóng)藝性狀的影響

從表3可以看出,EMS處理對(duì)不同胡麻品種M3農(nóng)藝性狀的影響存在差異?！嗊x3號(hào)’處理B4C2和B4C3,‘張亞2 號(hào)’處理B2C1 和B1C3,‘C9625’處理B3C1、B4C1、B2C2 株高低于對(duì)照外,其余處理均比對(duì)照高;‘CDC SoRel’和‘內(nèi)亞6號(hào)’各處理均高于對(duì)照?！嗊x3號(hào)’‘張亞2號(hào)’和‘內(nèi)亞6號(hào)’各處理工藝長度均比對(duì)照高,‘CDC SoRel’各處理均比對(duì)照高?！瓹DC SoRel’各處理分莖數(shù)均比對(duì)照高,‘內(nèi)亞6號(hào)’處理B1C2比對(duì)照低,其余處理均比對(duì)照高,‘C9625’‘輪選3號(hào)’和‘張亞2 號(hào)’各處理分莖數(shù)比對(duì)照有高有低?！瓹DC So Rel’和‘內(nèi)亞6號(hào)’各處理分枝數(shù)均比對(duì)照高,‘張亞2號(hào)’處理B1C2高于對(duì)照外,其余處理均比對(duì)照低;‘輪選3號(hào)’處理B4C3和B3C3,‘C9625’處理B1C5低于對(duì)照外,其余處理均比對(duì)照高?！瓹DC So Rel’和‘內(nèi)亞6號(hào)’各處理單株果數(shù)均比對(duì)照高,‘張亞2號(hào)’處理B2C1高于對(duì)照外,其余處理均比對(duì)照低;‘輪選3號(hào)’和‘C9625’各處理比對(duì)照有高有低?！畯垇?號(hào)’各處理比對(duì)照降低了千粒質(zhì)量,‘C9625’各處理均比對(duì)照高,而其他品種各處理比對(duì)照有高有低?！瓹DC SoRel’和‘內(nèi)亞6號(hào)’各處理比對(duì)照提高了單株產(chǎn)量,‘張亞2 號(hào)’各處理比對(duì)照降低了單株產(chǎn)量,‘輪選3號(hào)’和‘C9625’各處理比對(duì)照有高有低。

表3 EMS處理不同基因型胡麻品種M3代農(nóng)藝性狀Table 3 Agronomic traits of M3 generation in different flax under EMS treatment

2.4 EMS處理對(duì)M3品質(zhì)性狀的影響

不同處理對(duì)不同胡麻品種品質(zhì)性狀的影響見表4?！嗊x3 號(hào)’粗脂肪含量只有B1C1、B1C2處理高于對(duì)照,其余均低于對(duì)照;而木酚素含量各處理均高于對(duì)照,亞麻酸含量在處理B1C1 和B3C3高于對(duì)照,其余處理均低于對(duì)照;處理B1C1比對(duì)照降低了油酸含量和棕櫚酸含量,其余各處理均比對(duì)照高;各處理均比對(duì)照降低了硬脂酸含量。‘CDC SoRel’在處理B1C1、B1C2、B1C3 比對(duì)照提高了粗脂肪含量,在處理B1C3、B3C1比對(duì)照降低了木酚素含量,在處理B1C1、B1C2比對(duì)照提高了亞麻酸含量;在處理B2C2比對(duì)照降低了亞油酸含量,其余處理提高了亞油酸含量?！畯垇?號(hào)’在處理B1C1、B2C1比對(duì)照提高了粗脂肪含量,在處理B1C1比對(duì)照降低了木酚素含量,在處理B1C1和B2C1提高了亞麻酸含量;比對(duì)照降低了亞油酸含量,提高了硬脂酸含量?！瓹9625’在處理B2C2、B3C1比對(duì)照提高了粗脂肪含量,在處理B1C3、B1C5、B2C1比對(duì)照提高了木酚素含量,在處理B1C5、B2C2、B3C1均比對(duì)照提高了亞麻酸含量?！畠?nèi)亞6號(hào)’各處理比對(duì)照降低了粗脂肪和亞麻酸含量,提高了硬脂酸含量和油酸含量;在處理B4C1比對(duì)照提高了亞油酸含量,其余處理降低了亞油酸含量,提高了棕櫚酸含量;在處理B1C2比對(duì)照降低了木酚素含量,其余處理提高了木酚素含量。

表4 EMS處理下不同基因型胡麻品種M3代品質(zhì)性狀Table 4 Quality traits of M3 generation in different flax varieties under EMS treatment

2.5 不同胡麻品種M3代品質(zhì)優(yōu)異突變材料的篩選

對(duì)M3代各處理突變材料品質(zhì)變異情況進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)粗脂肪、木酚素和亞麻酸含量分別≥42%、≥10 mg/g和≥60%的材料數(shù)(表5)。其中‘內(nèi)亞6號(hào)’粗脂肪含量≥40%的材料有24份,沒有高于42%的材料;分別從‘輪選3號(hào)’‘CDC So Rel’‘C9625’選擇到亞麻酸含量高于55%的材料39份、40份和5份,但沒有高于60%的材料。從1 375份M3材料中選擇出高粗脂肪含量材料155份、高木酚素含量材料45份、高亞麻酸含量的材料26份,分別占總數(shù)的11.27%、3.27%和1.89%。其中從‘輪選3號(hào)’中選擇到高粗脂肪含量的材料比較多,從‘張亞2號(hào)’和‘內(nèi)亞6號(hào)’選擇出亞麻酸含量高的材料比較多。

表5 不同胡麻品種M3代品質(zhì)優(yōu)異突變材料的篩選Table 5 Selection of superior mutants of M3 generation in different flax varieties

2.6 不同基因型胡麻品種最佳EMS誘變條件篩選

以EMS處理時(shí)間X1和濃度X2為自變量,田間相對(duì)出苗率為因變量Y,利用線性回歸方程計(jì)算最佳EMS誘變條件。由于EMS 處理對(duì)不同粒色胡麻品種在發(fā)芽率和相對(duì)出苗率上存在顯著差異,因此根據(jù)籽粒顏色通過不同線性回歸方程計(jì)算最佳EMS 誘變條件。褐色籽粒Y1=1.254 5—0.055 7X1—0.537 1X2;淺黃色籽粒Y2=0.678 3—0.042 3X1—0.342 8X2,得到褐色籽粒胡麻品種的最佳誘變條件(0.6%,4 h),淺黃色籽粒品種為(0.3%,4 h)。為了獲得更有利的變異條件,通過統(tǒng)計(jì)不同處理品質(zhì)高于對(duì)照的株樹,發(fā)現(xiàn)較低濃度和處理時(shí)間可以提高胡麻粗脂肪和亞麻酸含量,‘輪選3 號(hào)’‘CDC SoRel’在處理?xiàng)l件(0.6%,2 h)獲得有利變異更多,‘C9625’在(0.6%,4 h)時(shí)獲得有利變異多,與回歸方程結(jié)果一致;在誘變條件(0.6%,4 h)時(shí)田間相對(duì)出苗率更接近50%,綜合品質(zhì)變異統(tǒng)計(jì)結(jié)果,最終得到褐色籽粒胡麻品種的最佳誘變條件(0.6%,4 h或2 h)。淺黃色籽粒品種回歸方程結(jié)果與變異統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致,最佳誘變條件為(0.3%,4 h)。

3 討論

本研究表明,不同EMS 處理對(duì)種子萌發(fā)以及幼苗生長有顯著的抑制作用,EMS 濃度越高處理時(shí)間越長,抑制作用就越顯著,發(fā)芽率和相對(duì)出苗就越低,與已有研究結(jié)果一致[10-12]。許燕等[13]研究表明。隨著EMS 濃度的增大,M1 種子存活率下降,與本研究結(jié)果一致。本研究表明,不同品種對(duì)不同EMS誘變處理反應(yīng)敏感度不同,尤其不同籽粒顏色的品種間,分析原因可能與不同籽粒顏色胡麻品種特性有關(guān),種子萌發(fā)時(shí)胚發(fā)育能力有差異;也可能與不同顏色種皮厚度或色素層不一致導(dǎo)致藥物滲透性有差異,還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。方差分析表明,不同品種、濃度和時(shí)間存在交互作用,對(duì)相對(duì)出苗率影響最大的因素是品種和處理濃度,與楊秀麗等[14]利用EMS誘變不同基因型花生品種的結(jié)果一致。

本研究通過EMS處理提高了M3代材料的株高、工藝長度、分枝數(shù)、單株果數(shù)和單株產(chǎn)量,千粒質(zhì)量影響不明顯,但不同品種和處理間也存在差異。這些變異有正向的,也有負(fù)向的,從中可能篩選出對(duì)育種有用的突變體,對(duì)今后胡麻高產(chǎn)育種具有積極意義。在油菜上,楊建勝等[15]研究表明,M1農(nóng)藝性狀除分枝數(shù)增加外,株高、主花序有效角果數(shù)、全株有效角果數(shù)、角果長度、角果粒數(shù)、千粒質(zhì)量等均顯著降低,與本研究結(jié)果不一致,可能與不同作物的誘變效應(yīng)不確定性有關(guān);黎詩艷等[16]研究表明,EMS 對(duì)苦蕎株高以及產(chǎn)量方面影響顯著,隨著處理濃度的增加,各個(gè)指標(biāo)呈遞減趨勢。本研究EMS 對(duì)產(chǎn)量性狀的影響結(jié)果,還需連續(xù)多代測定驗(yàn)證。王允等[17]通過研究花生EMS誘變M2種子的品質(zhì)性狀,發(fā)現(xiàn)誘變可以改變花生的品質(zhì),發(fā)現(xiàn)了粗脂肪含量高于對(duì)照的突變體。許燕等[13]EMS 誘變花生‘珍珠紅1號(hào)’篩選獲得9個(gè)優(yōu)良M5突變系,其中有4個(gè)表現(xiàn)出產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)異、綜合性狀優(yōu)良等特點(diǎn)。本研究對(duì)M3種子的品質(zhì)性狀進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)EMS誘變可以改變胡麻的品質(zhì),不同品種間、不同處理間品質(zhì)性狀變異存在差異,誘變效應(yīng)有正有負(fù)。從‘輪選3號(hào)’‘CDC SoRel’‘張亞2 號(hào)’可以看出,較低濃度和處理時(shí)間可以提高胡麻粗脂肪和亞麻酸含量,與陳碧云等[6]在油菜上研究結(jié)果一致。

從1 375份M3代材料中選擇出高粗脂肪材料155份、高木酚素含量材料45份、高亞麻酸含量的材料26份,說明通過EMS誘變產(chǎn)生新的優(yōu)異突變種質(zhì)是可行的。這些豐富的變異類型,為胡麻進(jìn)一步的遺傳改良提供了新的基因資源。魏中艷等[18]通過測定EMS誘變‘中品661’M2～M7籽粒的蛋白質(zhì)含量表明,高蛋白含量突變體在連續(xù)選擇過程中,蛋白含量呈下降趨勢;可能與高蛋白含量個(gè)體多為雜合狀態(tài),需要選擇純合高蛋白含量個(gè)體,才能創(chuàng)制出穩(wěn)定的高蛋白種質(zhì)。因此,在胡麻高代材料選擇純合單株測定品質(zhì),有利于選擇出性狀穩(wěn)定、品質(zhì)好的材料。袁潤勤等[19]利用SSR 和SRAP標(biāo)記檢測‘中雙9號(hào)’M3株系,結(jié)果表明138個(gè)株系沒有完全按表型突變聚在一起,但產(chǎn)生了可在分子水平上檢測的突變,而且誘變后代材料之間存在廣泛的遺傳差異。本試驗(yàn)主要調(diào)查了誘變后代的農(nóng)藝性狀變化及M3種子的品質(zhì)變化情況,并未對(duì)這些突變體產(chǎn)生的機(jī)理及其遺傳物質(zhì)的改變進(jìn)行研究,需進(jìn)一步從分子水平上檢測突變體遺傳物質(zhì)的變化情況,將有利于深入認(rèn)識(shí)EMS 對(duì)胡麻的誘變效應(yīng),為新品種選育奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過EMS 誘變不同基因型胡麻品種,發(fā)現(xiàn)不同胡麻品種間,尤其在不同籽粒顏色的胡麻品種間,發(fā)芽率和田間相對(duì)出苗率存在顯著差異。通過不同基因型胡麻品種、EMS處理時(shí)間和濃度3因素分析,對(duì)胡麻相對(duì)出苗率影響最大的因素是品種,其次是處理濃度和處理時(shí)間。最終得到褐色胡麻品種的最佳誘變條件(0.6%,4 h 或2 h),淺黃色籽粒品種最佳誘變條件(0.3%,4 h)。從1 375份M3代材料中選擇出高粗脂肪材料155份、高木酚素含量材料45份、高亞麻酸含量的材料26份。