王 燕 陳 為 董明鑫 孫成彪 張劍旭 常 影 劉文森 許 娜③

（中國農業(yè)科學院長春獸醫(yī)研究所，長春 130122）

近年隨著“魔剪”CRISPR/Cas9技術崛起，基因編輯在生物醫(yī)藥研究領域掀起了一股研究熱潮［1］。與傳統基因編輯技術（如鋅指核酸酶、活因子樣效應物核酸酶等）相比，CRISPR/Cas9技術采用特殊小向導RNA（single guide RNA，sgRNA）靶向目標基因，具有操作簡便、靶向效應強等優(yōu)點，成為當前基因研究領域的有力工具，已廣泛用于目的基因篩選編輯和藥物靶點篩選等領域［2-3］。髓樣分化因子88（myeloid-differentiation primary response protein 88，MyD88）是Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號轉導中的重要接頭分子，其介導的TLRs信號轉導稱為MyD88依賴型途徑，以形成MyD88、IRAK4和IRAK1復合體為標志，早期活化NF-κB和MAPK為特征［4］。近年研究發(fā)現，MyD88不僅在固有免疫中發(fā)揮重要作用，還可調控適應性免疫，是連接二者的橋梁，但部分機制尚不明確［5］。為深入開展MyD88功能及相關調控機制研究，本研究擬采用CRISPR/Cas9技術定點敲除MyD88基因，制備MyD88缺失的穩(wěn)定RAW264.7細胞株。

1 材料與方法

1.1 材料293T細胞株、RAW264.7細胞株、大腸桿菌菌株DH5-α均為本實驗室保存；三質粒系統（pSPAX2、pMD2G和穿梭質粒）、pHBLV-U6-gRNAEF1-ZsGreen載體（漢恒）；質粒DNA抽提試劑盒（Axygen）；限制性內切酶、T4連接酶（TaKaRa）；LipofiterTM轉染試劑盒、胎牛血清、1640培養(yǎng)液、0.25%胰酶、Puromycin（Life）；RNA提取試劑盒（奕杉）；MyD88抗體（Cell Signaling Technology）；羊抗兔IgG抗體（Proteintech）；Luminata forte western HRP substrate（Merck Millipore）；脂多糖LPS、肽聚糖PGN（Sigma Aldrich）；Mouse TNF-αELISA kit（達優(yōu)）；CO2細胞培養(yǎng)箱、低溫高速離心機（Thermo）；熒光顯微鏡（Olympus）；熒光定量PCR儀（ABI）；高端凝膠成像系統（Alpha Innotech）；高端多功能酶標儀（TECAN）；參照NCBI中目的基因序列，應用Primer 5.0軟件設計引物（表1），引物由上海生工生物公司合成；TNF-α引物購自GeneCopoeia。

1.2 方法

1.2.1 HBLV-Cas9-PURO慢病毒包裝和滴度測定將pSPAX2、pMD2G和攜帶Cas9基因的穿梭質粒進行擴增，經大量高純度無內毒素抽提后，共轉染293T細胞，6 h后更換為完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h和72 h，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清，4℃、2 000 g離心10 min，去除細胞碎片，收集病毒上清，離心120 min，得到高滴度慢病毒超離液（HBLV-Cas9-PURO）。分裝病毒、標記、-80℃保存。稀釋計數法測定病毒滴度（TU/ml）=細胞數×陽性克隆百分比×MOI×病毒稀釋倍數×103。

1.2.2 HBLV-Cas9-PURO感染、篩選及鑒定感染前1 d將RAW264.7細胞適當鋪板，細胞密度生長至30%～50%時，將HBLV-Cas9-PURO以MOI=20進行1/2小體積感染，4 h后補足至完全培養(yǎng)體積，24 h后更換新鮮完全培養(yǎng)液，48 h后熒光顯微鏡初步觀察GFP表達效率并更換含10μg/ml Puromycin的新鮮完全培養(yǎng)液進行Puromycin抗性篩選，進行穩(wěn)定株篩選及擴增，提取細胞總RNA，PCR檢測Cas9基因表達，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。PCR反應條件：94℃10 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)。

1.2.3 m-MyD88 gRNA重組載體構建和慢病毒包裝根據小鼠MyD88在NCBI的基因序列，為實現CRISPR/Cas9打靶載體用于小鼠MyD88基因敲除，設計3條sgRNA序列：m-MyD88 gRNA1、m-MyD88 gRNA2、m-MyD88 gRNA3（表2），由長春庫美公司合成后，退火成雙鏈Oligo序列，T4連接酶接入含ZsGreen熒光標記的pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen線性化表達載體，連接產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞，Amp抗性平板培養(yǎng)過夜，挑菌并擴大培養(yǎng)，菌液進行測序。將測序驗證正確的陽性克隆進行質粒提取和慢病毒包裝，慢病毒（HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA2-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP和HBLV-GFP NC對照）包裝及滴度測定方法同1.2.1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 sgRNA寡核苷酸序列Tab.2 Sequences of sgRNA oligonucleotides

1.2.4 HBLV-m-MyD88 gRNA-GFP感染及基因敲除效果鑒定篩選成功的RAW264.7-Cas9細胞以5×105個/ml鋪于6孔板，待細胞密度生長至30%～50%融合時，將包裝的各組慢病毒以MOI=30進行1/2小體積感染，感染后篩選過程及PCR鑒定方法同1.2.2。同時進行Western blot鑒定，提取感染后的RAW264.7-Cas9細胞蛋白，BCA定量后進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后轉至PVDF膜，5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h，加入抗MyD88抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，PBST洗膜3次，5 min/次，加入二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，5 min/次，滴加發(fā)光液，高端凝膠成像系統檢測MyD88表達。

1.2.5 MyD88基因敲除后TNF-α表達檢測為驗證敲除MyD88基因的RAW264.7細胞功能，采用MyD88基因激活劑LPS和PGN誘導敲除MyD88基因的RAW264.7細胞8 h，收集上清，ELISA試劑盒檢測TNF-α分泌情況；提取細胞總RNA、逆轉錄、熒光定量PCR檢測TNF-α表達。

1.3 統計學處理采用SPSS17.0軟件進行數據分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒滴度測定采用稀釋計數法對構建的慢病毒HBLV-Cas9-PURO、HBLV-GFP NC對照、HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA2-GFP、HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP進行滴度測定，測定結果見表3。

2.2 RAW264.7-Cas9細胞株鑒定將HBLV-Cas9-PURO感染并篩選后的細胞進行擴增，提取正常組和感染后的RAW264.7-Cas9細胞RNA，PCR檢測Cas9基因表達。與正常RAW264.7細胞比較，感染后Cas9基因擴增產物表達升高（圖1），表明獲得穩(wěn)定表達Cas9基因的RAW264.7細胞（RAW264.7-Cas9）。

表3 慢病毒滴度測定結果Tab.3 Results of lentivirus titer determination

2.3 gRNA重組載體測序結果 將單鏈sMyD88-gRNAs退火成雙鏈Oligo序列，連接入單酶切線性化的載體pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen。轉化子由上海漢恒生物科技公司進行測序（圖2），插入序列位置和方向與預期相符，證明3個載體構建成功。

2.4 RAW264.7-Cas9細胞感染及敲除效果鑒定各組慢病毒分別感染RAW264.7-Cas9后，熒光顯微鏡下觀察gRNA重組載體導入情況，結果顯示目的基因導入成功（圖3）。PCR檢測各組細胞MyD88基因表達，與對照組比較，HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后RAW264.7-Cas9細胞MyD88基因表達顯著下調（圖4A）。為進一步驗證敲除效果，采用Western blot檢測MyD88蛋白表達，結果顯示，HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP和HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后細胞MyD88蛋白表達均下降，且HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP組下降最為顯著（圖4B）。說明MyD88基因敲除成功，gRNA3組敲除效果最佳。

圖1 Cas9基因PCR結果Fig.1 PCR analysis of Cas9 gene

圖2 MyD88-gRNA測序圖Fig.2 Sequencing data of MyD88-gRNA

圖3 熒光顯微鏡下視野（×10）Fig.3 Field of vision under fluorescence microscope（×10）

圖4 MyD88基因敲除后PCR擴增產物及蛋白表達Fig.4 Expressions of PCR products and protein after MyD88 gene knockout

圖5 MyD88基因敲除后TNF-αmRNA表達Fig.5 Expression of TNF-αmRNA after MyD88 knock down

圖6 MyD88基因敲除后細胞上清TNF-α分泌水平Fig.6 Secretion level of TNF-αafter MyD88 knock down

2.5 MyD88基因敲除后TNF-α水平檢測 采用MyD88基因激活劑LPS（50 ng/ml）和PGN（20μg/ml）誘導RAW264.7和gRNA3組細胞8 h后，熒光定量PCR和ELISA檢測TNF-α表達與分泌水平，結果顯示，與誘導后正常RAW264.7細胞比較，敲除MyD88基因后TNF-α表達和分泌水平均下調（P＜0.05，圖5、6）。

3 討論

基因編輯技術是一種人為對目的基因片段進行基因敲除、特異突變引入或定點轉基因修飾的技術［6］。CRISPR/Cas9技術因高效、特異、操作簡易、周期短等優(yōu)點，逐漸成為目前基因編輯的主流，在生物學領域取得廣泛進展，并于2020年被授予諾貝爾化學獎［7］。CRISPR/Cas9系統通過sgRNA引導Cas9蛋白結合于基因外顯子區(qū)，Cas9蛋白對DNA雙鏈進行切割，通過非同源性末端連接導致隨機堿基插入/缺失，導致基因發(fā)生移碼突變，達到基因敲除目的［8］。本研究首先采用慢病毒感染方法獲得穩(wěn)定表達Cas9的RAW264.7細胞，構建及合成MyD88基因的sgRNA，采用慢病毒感染方式將sgRNA導入穩(wěn)定表達Cas9的RAW264.7細胞，最終敲除RAW264.7細胞中的MyD88基因。

TLRs屬于膜型模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），是單個跨膜非催化性蛋白，主要表達于單核-巨噬細胞、NK細胞、B淋巴細胞及樹突狀細胞等，由富含亮氨酸重復單位的胞外結構域、跨膜結構域和胞內Toll-白介素1受體（Toll-interleukin 1 receptor，TIR）結構域組成，而TIR的功能是募集下游接頭分子轉導信號［9］。MyD88蛋白是第一個被發(fā)現的TLRs接頭分子，其結構也為三部分：N端的死亡結構域（death domain，DD）、中間區(qū)域及C端的Toll區(qū)［10］。NF-κB是MyD88下游的關鍵轉錄因子，通常以p65和p50異二聚體形式存在，細胞靜息狀態(tài)下由于抑制蛋白IKβ結合，致使NF-κB滯留于細胞質，無法調控相關基因轉錄［11］。當TLRs與配體結合時，TIR與MyD88的C端Toll區(qū)形成復合體，引起DD結構域活化，募集IRAK1、IRAK4和TRAF6，TRAF6活化并激活TAK-1，使IKK（IKβkinase）磷酸化。磷酸化的IKK可催化IKβ泛素化降解，解除其對NF-κB的抑制，NF-κB由胞質進入胞核作用于反應原件，啟動一系列特定基因轉錄表達，產生細胞因子TNF-α、IL-1和IL-6等［12］。ADACHI等［13］對MyD88基因敲除的小鼠腹腔注射高劑量LPS，小鼠可存活96 h以上。本研究構建的穩(wěn)定敲除MyD88基因的RAW264.7細胞株經LPS和PGN誘導后，TNF-α表達明顯受抑制，與既往研究結果一致。

最新研究表明，MyD88在固有免疫和適應性免疫中均發(fā)揮作用，對自身免疫疾病、炎癥性疾病、感染性疾病和過敏性疾病等均有調控效應，但機制尚需進一步探究［14］。本研究采用CRISPR/Cas9系統，借助慢病毒感染方法，成功構建RAW264.7細胞MyD88基因缺失株，可為深入探尋MyD88基因作用提供重要載體。