楊 曦 高 鵬孫洋(三亞市人民醫(yī)院腫瘤外科,三亞 572000)
胃癌是世界上最常見惡性腫瘤之一,其病死率在所有惡性腫瘤中位居第三,僅次于肺癌和肝癌[1-2]。中國(guó)的胃癌發(fā)病率和病死率在所有惡性腫瘤中位居第二[3]。由于早期缺乏特異性癥狀和胃鏡檢查,多數(shù)患者在初診時(shí)已處于晚期[4]。近60%手術(shù)患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,其中位總生存期(overall survival,OS)不超過12個(gè)月[4]。胃癌患者預(yù)后較差的另一個(gè)原因是缺乏靶向藥物且現(xiàn)有靶向藥物均存在一定局限。雖然曲妥珠單抗聯(lián)合化療可提高患者OS,但僅有約20%患者過表達(dá)HER2,限制了曲妥珠單抗的應(yīng)用范圍[5-7]。貝伐珠單抗也僅能提高無進(jìn)展生存期和非亞裔患者OS[8]。雷莫蘆單抗聯(lián)合紫杉醇僅能用于二線治療[9]。非小細(xì)胞肺癌等其他腫瘤中取得突破性進(jìn)展的免疫治療對(duì)胃癌療效仍然欠佳,帕博利珠單抗在二線治療中單藥并不優(yōu)于紫杉醇,納武單抗也僅可用于三線及后期治療[10-11]。因此,闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)早期診斷、開發(fā)新的治療靶點(diǎn),更好改善胃癌患者的生存時(shí)間和質(zhì)量具有重要意義。
N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是真核生物最常見RNA修飾方式之一,廣泛存在于mRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA[12-14]。參與m6A修飾調(diào)控的蛋白大致可分為三類:m6A甲基化酶,包括METTL3、METTL14、WTAP等[15-17];m6A去甲基化酶,包括FTO、ALKBH5等[18-19];m6A識(shí)別蛋白,包括YTHDC1/2、YTHDF1/2/3等[20-24]。m6A修飾在包括胃癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤中具有重要調(diào)控作用[25-27]。FTO在急性髓系白血病、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等惡性腫瘤中具有重要調(diào)節(jié)作用[28-31]。FTO在胃癌中的作用僅有少量報(bào)道,其具體作用機(jī)制尚未明確[32]。因此,本研究擬分析FTO在胃癌中的表達(dá)及其表達(dá)與預(yù)后、臨床病理學(xué)特征的關(guān)系,進(jìn)一步證實(shí)FTO表達(dá)對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)機(jī)制。
1.1 材料BGC和SGC細(xì)胞系(上海中科院細(xì)胞庫);m6A檢 測(cè) 試 劑 盒(ab185912)、FTO一 抗(ab126605,Abcam公司);靶向人源FTO的siRNA、siRNA轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑(Santa Cruz);蛋白提取試劑盒(P0013,碧云天);抗FTO、c-MYC、CD47、PD-L1、GAPDH一抗抗體(Cell Signaling Technology);對(duì)應(yīng)抗兔、鼠二抗(Affinity)。
1.2 方法
1.2.1 FTO在胃癌及癌旁組織中的差異表達(dá)分析采用TCGA在線分析工具GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析FTO在胃癌及癌旁組織中的差異表達(dá)。
1.2.2 TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫分析采用cbioportal下載TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫,根據(jù)FTO mRNA表達(dá),等于或高于中位值為高表達(dá),低于中位值為低表達(dá)。在R Studio中采用“survival”和“survminer”程序包繪制生存曲線,Log-Rankt檢驗(yàn)分析兩組生存期有無差異。采用TCGA胃癌數(shù)據(jù)分析FTO表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系,分組方法同上,方差分析或Fisher確切概率法分析差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GEO在線工具K-M Plotter(http://kmplot.com/analysis/)分析FTO表達(dá)與PFS、OS的關(guān)系,根據(jù)FTO mRNA表達(dá),等于或高于中位值為高表達(dá),低于中位值為低表達(dá)。在TCGA-STAD隊(duì)列應(yīng)用基因富集分析FTO下游調(diào)節(jié)通路,采用SPSS19.0軟件進(jìn)行差異分析。
1.2.3 胃癌患者數(shù)據(jù)分析收集2011年至2016年進(jìn)行胃癌手術(shù)且經(jīng)病理證實(shí)為胃癌的87例患者臨床資料并進(jìn)行隨訪,統(tǒng)計(jì)無病生存期(disease free survival,DFS)和OS。胃癌患者石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本切片,脫蠟,EDTA抗原修復(fù),加入FTO一抗孵育,免疫組織化學(xué)染色陰性(-)或弱陽性(+)為低表達(dá)組,中陽性(++)或強(qiáng)陽性(+++)為高表達(dá)組。Log-Rank檢驗(yàn)分析兩組生存期有無差異,方差分析或Fisher確切概率法分析差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染采用RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)BGC和SGC細(xì)胞系。按照靶向人源FTO的siRNA及轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
1.2.5 總RNA m6A水平檢測(cè)SGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染FTO siRNA或?qū)φ誷iRNA后,采用TRIzol提取總RNA,根據(jù)m6A檢測(cè)試劑盒說明書,利用分光光度法檢測(cè)總RNA m6A水平。
1.2.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸至1×105個(gè)/100μl,接種至含24孔板的Transwell小室上室,下室加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,48 h后取出Transwell小室,甲醇固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色,PBS洗凈后顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。
1.2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸至50個(gè)/ml,在6孔板中加入100個(gè)細(xì)胞。14 d后甲醇固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色,PBS洗凈后計(jì)算克隆數(shù)。
1.2.8 Western blot BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后,加入RIPA裂解液裂解,離心,BCA測(cè)定蛋白濃度,取35μg蛋白,凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)膜,5%BSA封閉2 h,加入抗FTO、c-MYC、CD47、PD-L1、GAPDH 4℃孵育過夜,工作液濃度均為1∶1 000稀釋,洗膜,加入二抗室溫孵育2 h,洗膜3次后與發(fā)光液ECL反應(yīng),以β-actin為內(nèi)參,分析目的蛋白條帶相對(duì)表達(dá)。
2.1 胃癌及癌旁組織中FTO表達(dá)采用TCGA數(shù)據(jù)庫分析工具GEPIA對(duì)比胃癌及癌旁組織中FTO表達(dá),結(jié)果顯示FTO在胃癌組織中呈高表達(dá)(P<0.05,圖1)。
2.2 TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫中FTO表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系為進(jìn)一步探討FTO表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系,課題組在TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫中將所有胃癌患者按FTO mRNA表達(dá)分為高、低兩組,分別繪制了DFS和OS的K-M生存曲線,結(jié)果發(fā)現(xiàn):FTO高表達(dá)患者中位DFS更短(HR=1.75,95%CI:1.14~2.70,P=0.011 2,圖2A),中位OS也更短(HR=1.7,95%CI:1.19~2.42,P=0.003 5,圖2B)。
2.3 GEO數(shù)據(jù)庫中FTO表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系在GEO數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步驗(yàn)證FTO表達(dá)和預(yù)后的關(guān)系,下載GEO數(shù)據(jù)庫GSE14210、GSE15459、GSE22377、GSE29272、GSE51105、GSE62254等數(shù)據(jù)集,按FTO mRNA表達(dá)分為FTO高表達(dá)和FTO低表達(dá)組,分別計(jì)算中位無進(jìn)展生存期(progression free survivals,PFS)和中位OS并繪制K-M生存曲線,結(jié)果顯示:FTO mRNA高表達(dá)胃癌患者中位PFS更短(HR=1.59,95%CI:1.30~1.95,P<0.000 1,圖3A),中位OS也更短(HR=1.51,95%CI:1.27~1.79,P<0.000 1,圖3B)。
圖1 TCGA STAD隊(duì)列中腫瘤組織FTO表達(dá)高于正常組Fig.1 Tumor FTO expression was higher than normal in TCGA STAD cohort
圖2 TCGA中胃癌患者DFS/OS與FTO表達(dá)的關(guān)系Fig.2 Associations of DFS/OS and FTO expression of gastric cancer patients in TCGA
2.4 FTO表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系臨床研究收集87例胃癌患者手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色,按免疫組化染色強(qiáng)度分為FTO高表達(dá)(++或+++)和低表達(dá)(-或+)組,計(jì)算兩組中位DFS和中位OS并繪制K-M生存曲線,結(jié)果顯示:FTO高表達(dá)組患者中位DFS更短(HR=3.18,95%CI:1.76~5.75,P=0.000 1,圖4A),中位OS也更短(HR=1.72,95%CI:1.03~2.87,P=0.037 1,圖4B)。
2.5 TCGA數(shù)據(jù)庫中FTO表達(dá)與病理學(xué)特征的關(guān)系TCGA數(shù)據(jù)庫中FTO表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn),胃癌中FTO高表達(dá)和性別、M分期無關(guān),與年齡(P=0.001 0)、T分期(P=0.000 5)有關(guān),與N分期無關(guān)(P=0.051 7,表1)。
2.6 FTO表達(dá)與病理學(xué)特征的關(guān)系臨床研究進(jìn)一步分析87例胃癌患者FTO表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)胃癌中FTO高表達(dá)和性別、年齡、M分期、分化無關(guān),與T分期(P=0.005 6)、脈管侵襲(P=0.034 6)相關(guān),與N分期無關(guān)(P=0.063 9,表2)。
圖3 GEO中胃癌患者PFS/OS與FTO表達(dá)的關(guān)系Fig.3 Associations of PFS/OS and FTO expression of gastric cancer patients in GEO
圖4 87例胃癌患者DFS/OS與FTO表達(dá)的關(guān)系Fig.4 Associations between DFS/OS and FTO expression in 87 gastric cancer patients
2.7 FTO在胃癌中的調(diào)節(jié)作用為尋找FTO在胃癌中的具體調(diào)節(jié)作用,在TCGA-STAD隊(duì)列中采用GSEA尋找FTO下游調(diào)節(jié)通路,結(jié)果顯示,多個(gè)腫瘤相關(guān)通路在FTO高表達(dá)的通路中富集,包括E2F通路、氧化磷酸化通路、MYC通路等(圖5A)。鑒于兩個(gè)MYC相的基因集均被富集,課題組選擇MYC作為FTO潛在調(diào)節(jié)靶標(biāo)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在BGC細(xì)胞系中用siRNA敲低FTO表達(dá)后檢測(cè)總RNA m6A水平變化,結(jié)果顯示:相較于對(duì)照組,siRNA組總RNA m6A水平明顯降低(P=0.006 6,圖5B)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中,敲低FTO表達(dá)顯著抑制了BGC細(xì)胞和SGC細(xì)胞遷移(P<0.01,圖5C)??寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)中,F(xiàn)TO siRNA組較si-control組克隆形成數(shù)明顯減少(P<0.01和P<0.001,圖5D)。Western blot實(shí)驗(yàn)表明,敲低FTO表達(dá)后,c-MYC表達(dá)降低,CD47和PD-L1表達(dá)也降低(圖5E)。
表2 FTO表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationships between FTO expression and clinical pathological features
表1 FTO表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationships between FTO expression and clinical pathological features
2.8 FTO表達(dá)和免疫微環(huán)境的關(guān)系采用CIBERSORTx算法對(duì)TCGA中胃癌樣本進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)估算,并按FTO mRNA表達(dá)分為FTO高表達(dá)和FTO低表達(dá)組,對(duì)比兩組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)現(xiàn),F(xiàn)TO高表達(dá)組na?ve B細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞、單核細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、非活化的肥大細(xì)胞更多(P<0.05),F(xiàn)TO低表達(dá)組活化的肥大細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞更多(P<0.05,圖6)。
圖5 FTO通過調(diào)節(jié)m6A修飾調(diào)節(jié)MYC-CD47/PD-L1通路Fig.5 FTO regulates MYC-CD47/PD-L1 pathway by regulating m6A modification
圖6 FTO表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系Fig.6 Relationship between FTO expression and immune cell infiltration
本研究表明,F(xiàn)TO在胃癌中高表達(dá),且FTO高表達(dá)與更差的DFS、PFS、OS相關(guān),說明FTO可促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展。FTO表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系表明,F(xiàn)TO表達(dá)與T分期相關(guān),無論是在TCGA數(shù)據(jù)庫中還是本研究隊(duì)列中,F(xiàn)TO表達(dá)與N分期相關(guān)性的P均>0.05,但非常接近0.05(分別為0.051 7和0.063 9),說明FTO表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能相關(guān)。另外,本研究隊(duì)列中FTO表達(dá)與脈管侵襲相關(guān),也表明FTO表達(dá)可能與轉(zhuǎn)移有關(guān)。
GSEA表 明,c-MYC是FTO的 潛 在 調(diào) 節(jié) 靶 標(biāo)。本研究表明,F(xiàn)TO可通過m6A的方式調(diào)節(jié)c-MYC表達(dá)。研究表明,c-MYC可通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞中的CD47/PD-L1啟動(dòng)子區(qū)促進(jìn)其表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境和抗腫瘤反應(yīng)[33]。本研究表明,F(xiàn)TO可通過c-MYC調(diào)節(jié)CD47/PD-L1表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。
腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用,腫瘤中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞作用直接決定腫瘤發(fā)生發(fā)展及各種治療措施(尤其是免疫治療)的療效。因此,研究腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的影響對(duì)進(jìn)一步研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制和開發(fā)新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。本研究通過CIBERSORTx算法進(jìn)一步驗(yàn)證FTO與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系,結(jié)果表明,F(xiàn)TO表達(dá)與多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān),表明FTO通過調(diào)節(jié)c-MYC/CD47/PD-L1表達(dá)調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境。
綜上,本研究表明FTO在胃癌中表達(dá)升高且與更差的DFS、PFS、OS、T分期、脈管侵襲等相關(guān)。FTO通過其RNA去甲基化酶功能調(diào)節(jié)c-MYC/CD47/PD-L1表達(dá),進(jìn)而調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境。因此,F(xiàn)TO具有成為篩查診斷、判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物及新的候選靶點(diǎn)研發(fā)胃癌治療藥物的潛在價(jià)值。