楊 曦 高 鵬孫洋（三亞市人民醫(yī)院腫瘤外科，三亞 572000）

胃癌是世界上最常見惡性腫瘤之一，其病死率在所有惡性腫瘤中位居第三，僅次于肺癌和肝癌［1-2］。中國的胃癌發(fā)病率和病死率在所有惡性腫瘤中位居第二［3］。由于早期缺乏特異性癥狀和胃鏡檢查，多數(shù)患者在初診時已處于晚期［4］。近60%手術(shù)患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中位總生存期（overall survival，OS）不超過12個月［4］。胃癌患者預(yù)后較差的另一個原因是缺乏靶向藥物且現(xiàn)有靶向藥物均存在一定局限。雖然曲妥珠單抗聯(lián)合化療可提高患者OS，但僅有約20%患者過表達(dá)HER2，限制了曲妥珠單抗的應(yīng)用范圍［5-7］。貝伐珠單抗也僅能提高無進(jìn)展生存期和非亞裔患者OS［8］。雷莫蘆單抗聯(lián)合紫杉醇僅能用于二線治療［9］。非小細(xì)胞肺癌等其他腫瘤中取得突破性進(jìn)展的免疫治療對胃癌療效仍然欠佳，帕博利珠單抗在二線治療中單藥并不優(yōu)于紫杉醇，納武單抗也僅可用于三線及后期治療［10-11］。因此，闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對早期診斷、開發(fā)新的治療靶點(diǎn)，更好改善胃癌患者的生存時間和質(zhì)量具有重要意義。

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是真核生物最常見RNA修飾方式之一，廣泛存在于mRNA、長鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA［12-14］。參與m6A修飾調(diào)控的蛋白大致可分為三類：m6A甲基化酶，包括METTL3、METTL14、WTAP等［15-17］；m6A去甲基化酶，包括FTO、ALKBH5等［18-19］；m6A識別蛋白，包括YTHDC1/2、YTHDF1/2/3等［20-24］。m6A修飾在包括胃癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤中具有重要調(diào)控作用［25-27］。FTO在急性髓系白血病、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等惡性腫瘤中具有重要調(diào)節(jié)作用［28-31］。FTO在胃癌中的作用僅有少量報(bào)道，其具體作用機(jī)制尚未明確［32］。因此，本研究擬分析FTO在胃癌中的表達(dá)及其表達(dá)與預(yù)后、臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)FTO表達(dá)對腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料BGC和SGC細(xì)胞系（上海中科院細(xì)胞庫）；m6A檢 測 試 劑 盒（ab185912）、FTO一 抗（ab126605，Abcam公司）；靶向人源FTO的siRNA、siRNA轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑（Santa Cruz）；蛋白提取試劑盒（P0013，碧云天）；抗FTO、c-MYC、CD47、PD-L1、GAPDH一抗抗體（Cell Signaling Technology）；對應(yīng)抗兔、鼠二抗（Affinity）。

1.2 方法

1.2.1 FTO在胃癌及癌旁組織中的差異表達(dá)分析采用TCGA在線分析工具GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析FTO在胃癌及癌旁組織中的差異表達(dá)。

1.2.2 TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫分析采用cbioportal下載TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫，根據(jù)FTO mRNA表達(dá)，等于或高于中位值為高表達(dá)，低于中位值為低表達(dá)。在R Studio中采用“survival”和“survminer”程序包繪制生存曲線，Log-Rankt檢驗(yàn)分析兩組生存期有無差異。采用TCGA胃癌數(shù)據(jù)分析FTO表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，分組方法同上，方差分析或Fisher確切概率法分析差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GEO在線工具K-M Plotter（http：//kmplot.com/analysis/）分析FTO表達(dá)與PFS、OS的關(guān)系，根據(jù)FTO mRNA表達(dá)，等于或高于中位值為高表達(dá)，低于中位值為低表達(dá)。在TCGA-STAD隊(duì)列應(yīng)用基因富集分析FTO下游調(diào)節(jié)通路，采用SPSS19.0軟件進(jìn)行差異分析。

1.2.3 胃癌患者數(shù)據(jù)分析收集2011年至2016年進(jìn)行胃癌手術(shù)且經(jīng)病理證實(shí)為胃癌的87例患者臨床資料并進(jìn)行隨訪，統(tǒng)計(jì)無病生存期（disease free survival，DFS）和OS。胃癌患者石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本切片，脫蠟，EDTA抗原修復(fù)，加入FTO一抗孵育，免疫組織化學(xué)染色陰性（-）或弱陽性（+）為低表達(dá)組，中陽性（++）或強(qiáng)陽性（+++）為高表達(dá)組。Log-Rank檢驗(yàn)分析兩組生存期有無差異，方差分析或Fisher確切概率法分析差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染采用RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)BGC和SGC細(xì)胞系。按照靶向人源FTO的siRNA及轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.5 總RNA m6A水平檢測SGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染FTO siRNA或?qū)φ誷iRNA后，采用TRIzol提取總RNA，根據(jù)m6A檢測試劑盒說明書，利用分光光度法檢測總RNA m6A水平。

1.2.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸至1×105個/100μl，接種至含24孔板的Transwell小室上室，下室加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，48 h后取出Transwell小室，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗凈后顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸至50個/ml，在6孔板中加入100個細(xì)胞。14 d后甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗凈后計(jì)算克隆數(shù)。

1.2.8 Western blot BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，加入RIPA裂解液裂解，離心，BCA測定蛋白濃度，取35μg蛋白，凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉2 h，加入抗FTO、c-MYC、CD47、PD-L1、GAPDH 4℃孵育過夜，工作液濃度均為1∶1 000稀釋，洗膜，加入二抗室溫孵育2 h，洗膜3次后與發(fā)光液ECL反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白條帶相對表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁組織中FTO表達(dá)采用TCGA數(shù)據(jù)庫分析工具GEPIA對比胃癌及癌旁組織中FTO表達(dá)，結(jié)果顯示FTO在胃癌組織中呈高表達(dá)（P＜0.05，圖1）。

2.2 TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫中FTO表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系為進(jìn)一步探討FTO表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，課題組在TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫中將所有胃癌患者按FTO mRNA表達(dá)分為高、低兩組，分別繪制了DFS和OS的K-M生存曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：FTO高表達(dá)患者中位DFS更短（HR=1.75，95%CI：1.14～2.70，P=0.011 2，圖2A），中位OS也更短（HR=1.7，95%CI：1.19～2.42，P=0.003 5，圖2B）。

2.3 GEO數(shù)據(jù)庫中FTO表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系在GEO數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步驗(yàn)證FTO表達(dá)和預(yù)后的關(guān)系，下載GEO數(shù)據(jù)庫GSE14210、GSE15459、GSE22377、GSE29272、GSE51105、GSE62254等數(shù)據(jù)集，按FTO mRNA表達(dá)分為FTO高表達(dá)和FTO低表達(dá)組，分別計(jì)算中位無進(jìn)展生存期（progression free survivals，PFS）和中位OS并繪制K-M生存曲線，結(jié)果顯示：FTO mRNA高表達(dá)胃癌患者中位PFS更短（HR=1.59，95%CI：1.30～1.95，P＜0.000 1，圖3A），中位OS也更短（HR=1.51，95%CI：1.27～1.79，P＜0.000 1，圖3B）。

圖1 TCGA STAD隊(duì)列中腫瘤組織FTO表達(dá)高于正常組Fig.1 Tumor FTO expression was higher than normal in TCGA STAD cohort

圖2 TCGA中胃癌患者DFS/OS與FTO表達(dá)的關(guān)系Fig.2 Associations of DFS/OS and FTO expression of gastric cancer patients in TCGA

2.4 FTO表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系臨床研究收集87例胃癌患者手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，按免疫組化染色強(qiáng)度分為FTO高表達(dá)（++或+++）和低表達(dá)（-或+）組，計(jì)算兩組中位DFS和中位OS并繪制K-M生存曲線，結(jié)果顯示：FTO高表達(dá)組患者中位DFS更短（HR=3.18，95%CI：1.76～5.75，P=0.000 1，圖4A），中位OS也更短（HR=1.72，95%CI：1.03～2.87，P=0.037 1，圖4B）。

2.5 TCGA數(shù)據(jù)庫中FTO表達(dá)與病理學(xué)特征的關(guān)系TCGA數(shù)據(jù)庫中FTO表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，胃癌中FTO高表達(dá)和性別、M分期無關(guān)，與年齡（P=0.001 0）、T分期（P=0.000 5）有關(guān)，與N分期無關(guān)（P=0.051 7，表1）。

2.6 FTO表達(dá)與病理學(xué)特征的關(guān)系臨床研究進(jìn)一步分析87例胃癌患者FTO表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)胃癌中FTO高表達(dá)和性別、年齡、M分期、分化無關(guān)，與T分期（P=0.005 6）、脈管侵襲（P=0.034 6）相關(guān)，與N分期無關(guān)（P=0.063 9，表2）。

圖3 GEO中胃癌患者PFS/OS與FTO表達(dá)的關(guān)系Fig.3 Associations of PFS/OS and FTO expression of gastric cancer patients in GEO

圖4 87例胃癌患者DFS/OS與FTO表達(dá)的關(guān)系Fig.4 Associations between DFS/OS and FTO expression in 87 gastric cancer patients

2.7 FTO在胃癌中的調(diào)節(jié)作用為尋找FTO在胃癌中的具體調(diào)節(jié)作用，在TCGA-STAD隊(duì)列中采用GSEA尋找FTO下游調(diào)節(jié)通路，結(jié)果顯示，多個腫瘤相關(guān)通路在FTO高表達(dá)的通路中富集，包括E2F通路、氧化磷酸化通路、MYC通路等（圖5A）。鑒于兩個MYC相的基因集均被富集，課題組選擇MYC作為FTO潛在調(diào)節(jié)靶標(biāo)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在BGC細(xì)胞系中用siRNA敲低FTO表達(dá)后檢測總RNA m6A水平變化，結(jié)果顯示：相較于對照組，siRNA組總RNA m6A水平明顯降低（P=0.006 6，圖5B）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，敲低FTO表達(dá)顯著抑制了BGC細(xì)胞和SGC細(xì)胞遷移（P＜0.01，圖5C）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)中，F(xiàn)TO siRNA組較si-control組克隆形成數(shù)明顯減少（P＜0.01和P＜0.001，圖5D）。Western blot實(shí)驗(yàn)表明，敲低FTO表達(dá)后，c-MYC表達(dá)降低，CD47和PD-L1表達(dá)也降低（圖5E）。

表2 FTO表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationships between FTO expression and clinical pathological features

表1 FTO表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationships between FTO expression and clinical pathological features

2.8 FTO表達(dá)和免疫微環(huán)境的關(guān)系采用CIBERSORTx算法對TCGA中胃癌樣本進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤估算，并按FTO mRNA表達(dá)分為FTO高表達(dá)和FTO低表達(dá)組，對比兩組免疫細(xì)胞浸潤發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO高表達(dá)組na?ve B細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞、單核細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、非活化的肥大細(xì)胞更多（P＜0.05），F(xiàn)TO低表達(dá)組活化的肥大細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞更多（P＜0.05，圖6）。

圖5 FTO通過調(diào)節(jié)m6A修飾調(diào)節(jié)MYC-CD47/PD-L1通路Fig.5 FTO regulates MYC-CD47/PD-L1 pathway by regulating m6A modification

圖6 FTO表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系Fig.6 Relationship between FTO expression and immune cell infiltration

3 討論

本研究表明，F(xiàn)TO在胃癌中高表達(dá)，且FTO高表達(dá)與更差的DFS、PFS、OS相關(guān)，說明FTO可促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展。FTO表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系表明，F(xiàn)TO表達(dá)與T分期相關(guān)，無論是在TCGA數(shù)據(jù)庫中還是本研究隊(duì)列中，F(xiàn)TO表達(dá)與N分期相關(guān)性的P均＞0.05，但非常接近0.05（分別為0.051 7和0.063 9），說明FTO表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能相關(guān)。另外，本研究隊(duì)列中FTO表達(dá)與脈管侵襲相關(guān)，也表明FTO表達(dá)可能與轉(zhuǎn)移有關(guān)。

GSEA表 明，c-MYC是FTO的 潛 在 調(diào) 節(jié) 靶 標(biāo)。本研究表明，F(xiàn)TO可通過m6A的方式調(diào)節(jié)c-MYC表達(dá)。研究表明，c-MYC可通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞中的CD47/PD-L1啟動子區(qū)促進(jìn)其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境和抗腫瘤反應(yīng)［33］。本研究表明，F(xiàn)TO可通過c-MYC調(diào)節(jié)CD47/PD-L1表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。

腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，腫瘤中浸潤的免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞作用直接決定腫瘤發(fā)生發(fā)展及各種治療措施（尤其是免疫治療）的療效。因此，研究腫瘤細(xì)胞對腫瘤免疫微環(huán)境的影響對進(jìn)一步研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制和開發(fā)新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。本研究通過CIBERSORTx算法進(jìn)一步驗(yàn)證FTO與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系，結(jié)果表明，F(xiàn)TO表達(dá)與多種免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)，表明FTO通過調(diào)節(jié)c-MYC/CD47/PD-L1表達(dá)調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境。

綜上，本研究表明FTO在胃癌中表達(dá)升高且與更差的DFS、PFS、OS、T分期、脈管侵襲等相關(guān)。FTO通過其RNA去甲基化酶功能調(diào)節(jié)c-MYC/CD47/PD-L1表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境。因此，F(xiàn)TO具有成為篩查診斷、判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物及新的候選靶點(diǎn)研發(fā)胃癌治療藥物的潛在價值。