葉勵超 黃玉婷（福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經內科，泉州 362000）

實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是常用于研究人類多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的動物模型，其特征為CD4+T細胞介導的、體液免疫及補體共同參與、針對髓鞘自身抗原的炎癥反應，病理特征為中樞神經系統(tǒng)白質脫髓鞘、小血管周圍炎癥細胞浸潤，以單核細胞為主［1］。

維生素D（Vitamin D，VD）參與人體鈣、磷代謝和穩(wěn)態(tài)維持，是自身無法合成的微量有機物質。人體通過暴露于陽光下、膳食攝入和服用藥物等途徑補充VD。近年VD被用于治療多種免疫系統(tǒng)疾病，并取得了一定臨床效果［2］。流行病學研究表明，MS發(fā)病率與日光照射時間顯著相關［3］。早期生活時體內VD含量減少與MS患病風險可能存在某種關聯(lián)。有研究報道，MS患者VD水平較正常人明顯降低，提示人體VD缺乏或含量不足可能增加MS發(fā)病風險［4-6］。在動物模型中，補充VD可顯著減輕EAE神經功能缺失癥狀，但VD發(fā)揮保護作用的病理生理機制尚不明確［7］。

microRNAs（miRNAs）在調節(jié)細胞增殖、分化、炎癥反應、自身免疫性疾病和癌癥中發(fā)揮重要作用。miR-326通過調控抗原特異性T細胞和B細胞調控免疫系統(tǒng)功能并影響自身免疫性疾病進展［8-9］。臨床上MS患者在復發(fā)期和緩解期miR-326和miR-96均呈異常表達，說明miR-326和miR-96參與MS病理 形 成［10-11］。但VD是 否 通 過 調 節(jié)miR-326和miR-96進而影響MS進程尚未闡明。

因此，本研究通過建立EAE小鼠模型，評估VD對EAE小鼠細胞因子水平和miR-326和miR-96表達的影響，為MS的可能發(fā)病機制及防治提供實驗數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗小鼠48只6周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠，體質量20～25 g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀器MOG35-55（上海翊圣生物）；完全弗氏佐劑、百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）、DEPC（美國Sigma）；VD、多聚甲醛（上海生工）；無VD純化型飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司）；水合氯醛（上海Aladdin）；小鼠25-羥基維生素D3、小鼠IFN-γ、小鼠IL-10 ELISA試劑盒（北京麗科）；PCR引物、RT試劑、熒光定量PCR試劑、SYBR GreenⅠ（Western Biotechnology）；TRIzol（碧云天）；凝膠掃描系統(tǒng)（GDS8000，UVP，LLC）。

1.2 方法

1.2.1 EAE小鼠模型建立參考文獻［12］，小鼠于22℃、55%濕度、12 h光/12 h暗循環(huán)飼養(yǎng)，自由飲食飲水。將MOG35-55采用PBS稀釋至終濃度為0.5 mg/ml，與相同體積完全弗氏佐劑充分混合，制備0.25 mg/ml MOG35-55溶液，通過三通管將乳劑抽打為完全油包水狀態(tài)。每只小鼠給予200μg MOG35-55處理。第1次免疫當日（第0天）和第2天（48 h）分別在小鼠背部中線兩側4個穴位皮下注射MOG35-55（每點0.2 ml或500 ng）。PTX按500 ng PTX/0.2 ml PBS比例配制成PBS緩沖液，腹腔注射500 ng（或0.2 ml）PTX，構建EAE模型。

1.2.2 VD干預和分組將小鼠隨機分為VD干預組（VD組）和非VD干預組（NOVD組），每組24只。VD組小鼠喂食VD（200 U/d，5μg/d），隔天服用，連續(xù)30 d。在前期實驗基礎上，確定200 U/d為維持VD作用的最小劑量，VD組小鼠允許自由獲得缺乏VD的食物。NOVD組小鼠30 d內僅食用無VD純化型飼料。兩種飲食均在EAE誘導前1 d（-1 d）給予，之前接受正常飼料。將VD組和NOVD組小鼠隨機分為4個亞組：EAE誘導前組（-1 d）和EAE誘導后第10天組、第16天組、第30天組，每組6只。每天對小鼠進行監(jiān)測，觀察疼痛癥狀、行為，并記錄食欲和活動水平。

1.2.3 神經功能評估采用Benson評分標準分別于EAE誘導后第10、16和30天評估小鼠神經功能。0分：無臨床癥狀；1分：尾巴軟綿綿或搖搖擺擺的步態(tài)；2分：搖搖擺擺伴尾軟（共濟失調）；2.5分：共濟失調伴部分肢體癱瘓；3分：一側肢體完全癱瘓；3.5分：一側肢體完全癱瘓，另一側肢體部分癱瘓；4分：四肢完全癱瘓；4.5分：垂死動物；5分：瀕臨死亡或死亡。

1.2.4 ELISA小鼠腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg），取眼球采血，靜置2 h，4℃下3 000 r/min離心20 min，隨后分離上層血清用于ELISA試驗。每只小鼠取血清500μl，采用相應的ELISA試劑盒檢測血清IFN-γ、IL-10和25-羥基維生素D3含量。

1.2.5 RT-qPCR檢測采用放射免疫沉淀法從小鼠脊髓中提取總RNA，根據說明用cDNA合成試劑盒合成cDNA，SYBR GreenⅠPCR試劑盒檢測miR-326和miR-96表達，引物序列見表1。以外部線蟲miRNA（cell-miR-39）為內參。提取總RNA前將cell-miR-39以10 fmol/μl加 入 小 鼠 脊 髓 組 織 勻 漿中，PCR儀擴增，凝膠掃描系統(tǒng)處理，2-ΔΔCt法分析。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分 析，數(shù)據以±s表 示，組間 比較采用ANOVA和Tukey檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VD減輕EAE小鼠神經損傷神經功能評估過程中，NOVD組與VD組神經功能評分總體趨勢相似，分數(shù)先升高后降低。兩組小鼠神經功能評分均在EAE誘導后第16天達到最高值，癥狀最為嚴重。免疫后10 d和16 d，VD組小鼠神經功能評分均明顯低于NOVD組（P＜0.05）。免疫后30 d，NOVD組小鼠神經系統(tǒng)評分也高于VD組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1）。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

圖1 VD對EAE小鼠神經功能評分的影響Fig.1 Effects of VD on neurological scores of EAE mice

圖2 VD對EAE小鼠25-羥基維生素D3含量的影響Fig.2 Effects of VD on secretion of 25-hydroxyvitamin D3 in EAE mice

2.2 VD增強EAE小鼠25-羥基維生素D3分泌在造模前1 d與造模后第10天，VD組與NOVD組小鼠血清25-羥基維生素D3水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。EAE誘導后第16天和第30天，NOVD組小鼠25-羥基維生素D3水平保持不變（P＞0.05），VD組顯著升高（P＜0.000 1），且明顯高于NOVD組（P＜0.000 1，圖2）。

2.3 VD抑制EAE小鼠IFN-γ分泌、增加IL-10分泌EAE誘導前1天，VD組和NOVD組小鼠IFN-γ、IL-10水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），EAE誘導后第10、16和30天，兩組IFN-γ、IL-10水平均顯著升高（P＜0.05），但VD組IFN-γ明顯低于NOVD組（P＜0.000 1），IL-10水平明顯高于NOVD組（P＜0.000 1），建模后第16天，IFN-γ達到最高水平，IL-10達到最低水平（圖3）。

2.4 VD下 調EAE小 鼠miR-326和miR-96表 達VD組小鼠在EAE誘導后第10、16和30天，miR-326表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但與NOVD組相比顯著降低（P＜0.01，圖4A）。NOVD組小鼠EAE誘導后第10、16和30天，miR-96表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但VD組較NOVD組顯著降低（P＜0.001，圖4B）。

圖3 VD對EAE小鼠IFN-γ和IL-10含量的影響Fig.3 Effects of VD on secretion of IFN-γand IL-10 in EAE mice

圖4 VD對EAE小鼠miR-326和miR-96表達的影響Fig.4 Effects of VD on expressions of miR-326 and miR-96 in EAE mice

3 討論

MS是一種慢性自身免疫紊亂性疾病，主要損傷中樞神經系統(tǒng)的大腦白質和脊髓，具有多病灶、易復發(fā)等特點。疾病常導致患者遺留感覺、運動等神經系統(tǒng)功能障礙，嚴重威脅個人、家庭和社會健康。EAE動物模型的臨床特點、免疫應答和病理變化與人類MS高度一致，因此常用于MS研究，但MS發(fā)病的具體機制尚未闡明。目前多數(shù)學者認為，MS和EAE的免疫學機制均為T細胞和B細胞靶向髓鞘特異抗原導致的炎癥性脫髓鞘反應。

研究報道，增加陽光照射和VD攝入可提高人體活性VD濃度，日照時間少、VD含量低可能是MS的重要危險因素［3-5］。補充VD能部分減輕MS患者炎癥脫髓鞘［13］。多項實驗也證實VD治療具有保護EAE、減輕神經系統(tǒng)損傷作用，其可能機制如下：mTOR是一個重要的真核細胞信號，可影響細胞因子表達，VD通過抑制多效性細胞mTOR通路參與免疫抑制［14-15］；自噬在保護神經元功能中扮演關鍵角色，VD具有調節(jié)自噬、減輕神經元損傷作用［16］；通過誘導Nrf2/血紅素加氧酶1/一氧化碳軸預防EAE［17］。本研究顯示，VD治療組EAE小鼠神經功能評分顯著降低，表明VD可能減輕EAE炎癥性脫髓鞘損傷，發(fā)揮神經保護作用。EAE誘導后的第16天和第30天，小鼠血清25-羥基維生素D3水平顯著升高，提示作為VD的一種活性形式，25-羥基維生素D3參與EAE炎癥過程，能夠有效減輕臨床癥狀，與既往研究結論一致［18］。表明補充VD治療對EAE小鼠有保護作用，可能間接激活25-羥基維生素D3產生。但有學者認為25-羥基維生素D3在EAE自身免疫應答中不起關鍵作用，因為缺乏VD受體的EAE小鼠也部分受到VD保護［19］。本研究在EAE誘導后第10天，VD組和NOVD組血清25-羥基維生素D3水平差異無統(tǒng)計學意義，推測體內25-羥基維生素D3分泌存在復雜的調節(jié)機制，有待深入研究。

CD4+T細胞可介導MS炎癥脫髓鞘過程，輔助性T（Th）細胞進一步分化為不同亞群，包括Th1、Th2、Th17和調節(jié)性T細胞，通過分泌細胞因子和趨化因子協(xié)調不同免疫效應。由Th1細胞分泌的炎癥因子，如IFN-γ、TNF、IL-12等深入參與MS發(fā)生和進展，Th2細胞分泌的炎癥因子，如IL-10，TGF-β等可以有效減輕MS炎癥和緩解疾病；Th17細胞分泌IL-17、IL-6和TNF-α等細胞因子，促發(fā)MS患者中樞神經系統(tǒng)炎癥和組織損傷［20］。細胞因子IFN-γ參與自身免疫病理生理過程，是導致MS和EAE發(fā)病的主要炎癥遞質，IFN-γ水平升高可誘發(fā)和加重疾病。EAE小鼠在禁食后IFN-γ分泌減少，神經損傷嚴重程度明顯降低［21］。本研究VD組小鼠IFN-γ水平明顯低于NOVD組，提示VD可抑制IFN-γ分泌，從而間接緩解EAE癥狀。細胞因子IL-10能減輕EAE炎癥反應。近年研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞可促進小膠質細胞表型極化，由M1型轉變?yōu)镸2型，從而改善EAE相關神經功能，其特征為IL-10表達增加［22］。本研究顯示，VD在EAE誘導后第10、16和30天促進IL-10分泌，減輕EAE小鼠神經損傷。但在EAE造模后第16天，IL-10水平未見顯著差異（VD組僅輕微升高），可能與EAE小鼠該天神經功能評分達到峰值、癥狀最嚴重有關。

miRNA參與機體炎癥反應與免疫系統(tǒng)功能調節(jié)，通過影響T細胞和B細胞功能調控自身免疫性疾病進展。miR-326是Th17細胞相關miRNA，在MS復發(fā)和緩解期顯著過表達［10］；miR-96可增強Th17細胞致病性，復發(fā)緩解型MS患者血漿miR-96表達增強［23］。VD干預是否會影響EAE小鼠模型miR-326和miR-96表達尚不清楚。本研究測定了這兩種miRNAs表達，結果發(fā)現(xiàn)VD干預的EAE小鼠miR-326和miR-96表達明顯減少，提示VD可能通過抑制miR-326和miR-96表達從而調節(jié)自身免疫與炎癥反應，改善EAE小鼠神經功能。此前一項研究表明，VD受體被預測為miR-326的直接靶點，相關機制有待進一步研究［24］。

總之，本研究證實VD能促進小鼠體內25-羥基維生素D3形成，VD可能通過減少IFN-γ生成、促進IL-10分泌、下調miR-326和miR-96表達改善EAE小鼠神經功能。實驗結果支持VD對EAE小鼠發(fā)揮保護作用的事實，從而為EAE提供了一種潛在治療方法。本研究存在一定局限性，如各組實驗動物數(shù)量較少；未進一步闡明miR-326和miR-96對T細胞和Th17細胞反應的影響，如Th17/Treg平衡，需要更多實驗探究miR-326和miR-96在EAE中的作用，未研究VD對VD受體表達的調控作用。