余海靜 汪 琳 王志斌 劉 陽

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，武漢 430030）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是最常見的、由環(huán)境變應(yīng)原（主要包括草花粉和塵螨）誘導(dǎo)的IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，影響全球10.5%～25%人口［1］。盡管患者可接受口服抗組胺藥、鼻內(nèi)類固醇皮質(zhì)激素和過敏原免疫治療，但效果欠佳［2］。因此，迫切需要尋找更有效的治療方法。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）在炎癥性疾病中控制免疫平衡［3］。Tregs通過分泌抑制性細(xì)胞因子（如IL-10和TGF-β1）發(fā)揮作用［4］。此外，Tregs通過細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4和組胺受體2等膜結(jié)合分子發(fā)揮生物學(xué)功能［5］。Tregs功能失衡參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎、癌癥、氣道疾病等發(fā)病過程［6］。Tregs對疾病免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用已被廣泛研究，因此尋求增強T調(diào)節(jié)反應(yīng)的治療方法越來越受到重視［7］。

Clara細(xì)胞10 kD蛋白（CC10）是分泌珠蛋白家族成員，課題組前期結(jié)果表明其具有免疫調(diào)節(jié)作用［8］。此外，課題組最近數(shù)據(jù)還表明CC10可抑制AR模型局部Th17反應(yīng)［9］。但其對T調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用尚未研究。因此，本研究擬探討CC10對AR小鼠T細(xì)胞反應(yīng)及T調(diào)節(jié)細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物8周齡C57BL/6J小鼠取自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，置于SPF級環(huán)境飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑OVA（Ⅴ級，Sigma）；ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 AR小鼠建模及CC10給藥參考課題組前期方法建立AR小鼠模型［10］，將小鼠分為4組：對照組（Control）、AR組、AR+CC10組和AR+PBS組，每組5只。AR組小鼠第0、7天皮下注射10μg OVA和1.6 mg氫氧化鋁，第14～18天每天用10μg OVA加至40μl PBS進行鼻內(nèi)激發(fā)（20μl/鼻孔）。對照組用PBS致敏，OVA激發(fā)。最后1次激發(fā)24 h后處死小鼠。AR+CC10組小鼠每次OVA激發(fā)前2 h在40μl PBS中加入1.4μg CC10進行鼻腔滴入（20μl/鼻孔）。AR+PBS組小鼠僅給予等量PBS。

1.2.2 小鼠搔鼻次數(shù)計數(shù)統(tǒng)計最后1次經(jīng)鼻PBS或OVA激發(fā)24 h后，兩名觀察者記錄10 min內(nèi)搔鼻次數(shù)。

1.2.3 鼻腔灌洗液（nasal lavage fluid，NLF）獲取按課題組前期方法收集NLF［10］。離心NLF，取上清，-80℃保存，ELISA測定細(xì)胞因子水平。NLF細(xì)胞沉淀物稀釋于1 ml PBS用于HE染色。

1.2.4 ELISA檢測NLF中IFN-γ、TGF-β1、IL-10、IL-17、IL-5水平按照ELISA試劑盒說明檢測IFN-γ、TGF-β1、IL-10、IL-17、IL-5水平，IFN-γ檢測靈敏度為5 pg/ml，TGF-β1和IL-5檢 測靈敏 度 為2 pg/ml，IL-10和IL-17檢測靈敏度為1 pg/ml。

1.2.5 組織病理學(xué)按課題組前期方法制備鼻腔黏膜載玻片［9］。對杯狀細(xì)胞進行Schiff染色。在4個隨機選擇的區(qū)域中對上皮杯狀細(xì)胞進行計數(shù)，杯狀細(xì)胞以上皮包含個數(shù)/mm表示。將稀釋后的NLF細(xì)胞置于載玻片上風(fēng)干，用于HE染色。隨機選取4個視野進行嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)分析。NLF嗜酸性粒細(xì)胞表達為：個/ml。

1.2.6 定量PCR參照課題組前期方法進行定量PCR［9］。PCR法檢測基因mRNA表達。引物序列：FOXP3正向引物5′-GCCAAGCAGAAAGATGACAG-3′，反向引物5′-TTCCAGATGTTGTGGGTGAG-3′；β-actin正向引物5′-GCAGAAGGAGATTACTGCTCT-3′；反向引物5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS23.0軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s表示。采用單因素方差檢驗比較不同組結(jié)果，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CC10改善AR小鼠鼻部搔鼻癥狀A(yù)R小鼠經(jīng)鼻OVA激發(fā)后出現(xiàn)搔鼻癥狀，搔鼻次數(shù)顯著多于對照組（P＜0.01）。CC10治療明顯減輕了AR小鼠搔鼻癥狀，與PBS處理組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

2.2 CC10降低AR小鼠NLF中嗜酸性粒細(xì)胞及上皮杯狀細(xì)胞數(shù)細(xì)胞滴片HE染色結(jié)果顯示，AR組小鼠嗜酸性粒細(xì)胞明顯多于對照組（P＜0.01），CC10處理明顯抑制嗜酸性粒細(xì)胞增加（P＜0.05）。杯狀細(xì)胞計數(shù)顯示AR組小鼠上皮杯狀細(xì)胞明顯多于對照組（P＜0.01），CC10處理明顯抑制杯狀細(xì)胞增加（P＜0.05，圖2）。

2.3 CC10降低IL-5和IL-17細(xì)胞因子水平AR組小鼠NLF中IL-5、IL-17水平較對照組顯著升高（P＜0.05），IFN-γ水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，CC10處理后，IL-5、IL-17水平明顯降低（P＜0.05，圖3）。

圖1 各組小鼠搔鼻次數(shù)比較Fig.1 Comparison of nasal rubs among different groups

圖2 各組小鼠NLF中嗜酸性粒細(xì)胞及上皮中杯狀細(xì)胞比較（×200）Fig.2 Comparison of eosinophils and goblet cells in NLF of mice in different groups（×200）

圖3 各組小鼠NLF中IL-5、IL-17及IFN-γ表達比較Fig.3 Comparison of levels of IL-5，IL-17 and IFN-γin NLF of mice in different groups

圖4 各組小鼠鼻黏膜FOXP3及NLF中TGF-β1及IL-10表達比較Fig.4 Comparison of levels of FOXP3 in nasal mucosa and TGF-β1，IL-10 in NLF of mice in different groups

2.4 CC10促進小鼠鼻黏膜FOXP3表達及NLF中TGF-β1、IL-10表達與對照組相比，AR組小鼠FOXP3 mRNA表達增強（P＜0.05），CC10處理顯著增強其表達。對照組和AR組小鼠IL-10和TGF-β1水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而CC10治療組小鼠IL-10和TGF-β1水平顯著升高（P＜0.05，圖4）。

3 討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)CC10可減輕AR小鼠臨床癥狀，同時減輕鼻黏膜局部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，減少杯狀細(xì)胞增生，降低Th2和Th17反應(yīng)，但增加Tregs反應(yīng)。

CC10是一種抗炎蛋白，參與調(diào)節(jié)氣道疾病發(fā)展［9］。最近研究表明，CC10可抑制AR模型中Th17反應(yīng)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)OVA激發(fā)導(dǎo)致AR小鼠氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和杯狀細(xì)胞增生，CC10可顯著改善AR小鼠以上病理學(xué)特征，與課題組前期研究結(jié)果一致。CC10可顯著降低IL-5和IL-17水平，而對IFN-γ無影響，提示CC10對Th2和Th17細(xì)胞具有抑制作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CC10在致敏階段可通過降低樹突狀細(xì)胞OX40配體、IL-6和IL-23表達而抑制Th17反應(yīng)，但同時促進樹突狀細(xì)胞TGF-β1和CD86表達［10］。而在激發(fā)階段，CC10可降低鼻黏膜局部CCL20和IL-23表達。因此，CC10的作用機制尚不清楚，有待進一步研究。

迄今為止，不同過敏原特異性T細(xì)胞亞型（Th1、Th2、Th17和Tregs）已被證實與過敏性氣道疾病有關(guān)［11］。T輔助細(xì)胞和Tregs失調(diào)可導(dǎo)致過敏性疾病發(fā)展［11］。研究表明，外周Tregs在控制T細(xì)胞反應(yīng)方面起關(guān)鍵作用［12］。人類和動物模型中，Tregs缺失或功能缺陷與過敏性氣道疾病、自身免疫性疾病和癌癥相關(guān)［12］。已知的Tregs亞群中，有兩個Tregs亞群受到了特別關(guān)注，即胸腺中自然產(chǎn)生的Tregs和外周產(chǎn) 生 的Tregs［13］。外 周 產(chǎn) 生 的Tregs還 包 括Tr1和Th3兩個細(xì)胞亞群，其特征分別為分泌IL-10和TGF-β1［14］。本研究表明，CC10可顯著增加AR小鼠鼻黏膜局部FOXP3表達，CC10治療后IL-10和TGFβ1水平顯著升高。本研究表明Tregs在CC10的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用中發(fā)揮重要作用。

研究表明吲哚胺-2，3-雙加氧酶（IDO）、TGF-β1、IL-10和前列腺素E2（PGE2）等分子決定了Tregs分化［15-16］。本研究觀察到CC10顯著增加AR小鼠鼻黏膜中TGF-β1和IL-10表達，提示TGF-β1和IL-10可能是CC10影響AR小鼠Tregs擴增的主要因素。由于CC10在氣道疾病中具有較強抗炎作用，課題組推測其可能通過增強IDO和PGE2表達促進T調(diào)節(jié)反應(yīng)，但還需進一步闡明。

總之，CC10可能通過調(diào)控T細(xì)胞反應(yīng)改善AR小鼠鼻腔炎癥狀態(tài)，具體機制還需進一步研究。