胡子琪 吳 旭 姚朵朵 李燕秀 孫志夫 王 璽 張須龍

（首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，北京 100069）

下呼吸道感染是導(dǎo)致全球全年齡段人類(lèi)發(fā)病和死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康［1］。在呼吸道感染病原體中，流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等RNA病毒感染后易繼發(fā)細(xì)菌感染，引起重癥肺炎和肺臟免疫損傷，是呼吸道病毒感染流行期間導(dǎo)致死亡的主要原因［2-4］。繼發(fā)細(xì)菌感染引起的免疫病理?yè)p傷是重癥肺炎的重要原因，但其中的免疫致病機(jī)制尚不完全清楚。

由天然免疫細(xì)胞和天然免疫分子介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答是宿主抵御病原體感染的第一道防線［5］。補(bǔ)體作為機(jī)體重要的天然免疫分子，可通過(guò)經(jīng)典途徑、凝集素途徑和旁路途徑活化，在天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮不可或缺的作用，可通過(guò)直接裂解、調(diào)理作用、促進(jìn)吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)和放大T/B細(xì)胞反應(yīng)等介導(dǎo)抗感染免疫應(yīng)答，其中補(bǔ)體C3是補(bǔ)體活化的核心，可通過(guò)酶解形成多種免疫分子調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答［6］。甘露糖結(jié)合凝集素（mannose-binding lectin，MBL）、ficolin和collectin-10/11是啟動(dòng)凝集素途徑的關(guān)鍵模式識(shí)別分子，在抗感染免疫應(yīng)答早期發(fā)揮關(guān)鍵作用［7-9］。其中ficolin是由C端球形糖類(lèi)識(shí)別功能區(qū)、中間α卷曲螺旋區(qū)和N端膠原樣區(qū)組成，人類(lèi)體內(nèi) 存 在M-ficolin、L-ficolin和H-ficolin三 種類(lèi)型，小鼠體內(nèi)存在ficolin A和ficolin B兩種類(lèi)型［10］。Ficolin具有肺臟持續(xù)高表達(dá)、血清濃度遠(yuǎn)高于MBL、可識(shí)別多種配體等特點(diǎn)，在抗呼吸道感染中發(fā)揮重要作用，且ficolin缺失易導(dǎo)致肺臟反復(fù)感染［11］。Ficolin在病毒繼發(fā)細(xì)菌感染中的作用及機(jī)制尚未明確，深入探討其作用有助于闡明其致病機(jī)制并尋找潛在治療靶點(diǎn)。

RNA病毒感染靶細(xì)胞后，會(huì)在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄時(shí)形成雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA），它是重要的病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），可通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）激活天然免疫應(yīng)答介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［12］。Poly（I：C）是一種人工合成的dsRNA類(lèi)似物，廣泛用于模擬RNA病毒感染的各類(lèi)實(shí)驗(yàn)研究［13-14］。本研究通過(guò)革蘭氏陰性菌來(lái)源的內(nèi)毒素LPS刺激poly（I：C）預(yù)處理的小鼠，模擬RNA病毒繼發(fā)細(xì)菌感染的急性加重模型，并探討ficolin在RNA病毒繼發(fā)細(xì)菌感染急性加重肺損傷的作用及機(jī)制，為繼發(fā)細(xì)菌感染的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠和ficolin基因敲除小鼠由首都醫(yī)科大學(xué)和蘇州賽業(yè)公司提供，并經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部倫理管理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：AEEI-2018-090）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.3 試劑和儀器Poly（I：C）和LPS購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；抗C3單克隆抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；抗β-actin單克隆抗體、抗tubulin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；膠原酶Ⅰ購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；BB515-rat anti-mouse CD45、BUV737-rat anti-mouse CD11b、BUV395-rat anti-mouse Ly6G、BV421-rat anti-mouse F4/80、BV650-rat anti-mouse MHCⅡ、AF700-rat antimouse Ly6C、FVS510染料、CD16/CD32封閉液、FACSymphony流式細(xì)胞儀、FlowJo V10流式分析軟件購(gòu)于美國(guó)BD公司；全自動(dòng)切片掃描儀Pannoramic Scan購(gòu)于匈牙利3DHIESTECH公司；AI600超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)于美國(guó)GE公司。

1.2 方法

1.2.1 Poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激小鼠模型的建立6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠和ficolin基因敲除小鼠隨機(jī)分為PBS組、poly（I：C）組、LPS組以及poly（I：C）和LPS聯(lián)合刺激組。通過(guò)異氟烷或乙醚麻醉，聯(lián)合刺激組小鼠于造模第1天和第2天分別滴鼻給予25μl含50μg的poly（I：C），于造模第3天滴鼻給予25μl含50μg的LPS；poly（I：C）組和LPS組小鼠僅滴鼻給予等量poly（I：C）或LPS，其余進(jìn)行等量PBS處理；PBS組小鼠于造模3 d滴鼻給予等量的PBS。在造模第5天處死小鼠取其肺臟組織進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 Poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激RAW264.7細(xì)胞模型的建立將RAW264.7細(xì)胞于DMEM完全培養(yǎng)基中37℃、5%CO2培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，在12孔板中以1×106個(gè)/孔的密度接種，分為PBS組、poly（I：C）組、LPS組以及poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激組，每組3個(gè)復(fù)孔；50μg/ml的poly（I：C）或等量PBS處理18 h后，聯(lián)合50 ng/ml LPS或等量PBS刺激6 h，收集RAW264.7細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)C3蛋白的表達(dá)取各刺激或?qū)φ战M小鼠肺臟組織進(jìn)行剪碎研磨，以及收取各處理或?qū)φ战MRAW264.7細(xì)胞樣本，采用RIPA蛋白裂解法提取組織或細(xì)胞中的總蛋白，冰浴30 min后，12 000 r/min、4℃離心15 min，收集上清液。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，并稀釋所有蛋白樣本為相同濃度，99℃加熱5 min蛋白質(zhì)變性后，進(jìn)行SDSPAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至甲醇預(yù)浸泡過(guò)的PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h后加入相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，使用ECL顯色液于AI600超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行掃描。

1.2.4 肺臟組織HE染色將各刺激或?qū)φ战M小鼠肺臟組織置入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片用于常規(guī)HE染色。石蠟切片烘烤40 min，常規(guī)脫蠟水化，蘇木精復(fù)染4 min，鹽酸乙醇分化2 s，返藍(lán)30～40 min，伊紅染色2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后，使用病理切片掃描儀進(jìn)行圖像收集。

1.2.5 中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞流式檢測(cè)取各刺激或?qū)φ战M小鼠肺臟組織剪碎后于消化液（每5 ml消化液由4.25 ml DMEM培養(yǎng)基、500μl膠原酶Ⅰ、250μl胎牛血清組成）中37℃消化1 h，于70μm細(xì)胞篩網(wǎng)上輕柔研磨過(guò)濾得到肺組織細(xì)胞懸液，1 500 r/min、4℃離心10 min，加入紅細(xì)胞裂解液室溫避光5 min，PBS稀釋后再次通過(guò)70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，PBS洗滌2次，加入FVS510染料，室溫避光孵育15 min，洗滌1次，依次加入封閉液、BB515-rat anti-mouse CD45、BUV737-rat anti-mouse CD11b、BUV395-rat anti-mouse Ly6G、BV421-rat anti-mouse F4/80、BV650-rat anti-mouse MHCⅡ和AF700-rat anti-mouse Ly6C熒光標(biāo)記流式抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次后于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo V10軟件分析每組小鼠中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和間質(zhì)巨噬細(xì)胞的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism 8.0軟件。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS加重poly（I：C）預(yù)刺激的小鼠肺臟損傷如圖1A所示，在第1、2天連續(xù)用50μg poly（I：C）預(yù)刺激，在第3天用50μg LPS滴鼻刺激建立小鼠聯(lián)合刺激模型。相較于未刺激和單獨(dú)刺激對(duì)照組，聯(lián)合刺激組小鼠駝背姿勢(shì)、豎毛現(xiàn)象更明顯，呼吸加快以及活動(dòng)度更低。在刺激第5天小鼠肺組織病理表現(xiàn)為：PBS組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和出血，poly（I：C）或LPS單獨(dú)刺激組小鼠肺組織支氣管腔和血管腔周?chē)梢?jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腔內(nèi)有較少出血，肺泡少量融合；而在聯(lián)合刺激組中，可見(jiàn)肺泡融合和彌漫性損傷，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)于支氣管和血管周?chē)?，支氣管腔?nèi)充血滲出，病理?yè)p傷加重（圖1B）。上述結(jié)果表明LPS加重poly（I：C）預(yù)刺激的小鼠肺臟損傷，模型建立成功。

2.2 中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞招募參與LPS誘導(dǎo)的poly（I：C）預(yù)刺激的急性肺臟損傷取肺組織單個(gè)細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各處理組和對(duì)照組中性粒細(xì)胞、間質(zhì)巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的比例變化。結(jié)果顯示，相較于PBS組，poly（I：C）、LPS單獨(dú)刺激組和聯(lián)合刺激組第5天，小鼠肺臟中性粒細(xì)胞（CD45+CD11b+Ly6G+）比例分別由2.4%升高至11.1%、15.3%和19.8%（圖2A），間質(zhì)巨噬細(xì)胞（CD45+CD11b+Ly6G-F4/80+MHCⅡ+Ly6C+）比例分別由3.0%升高至13.2%、22.8%和30.1%（圖2B），而肺泡巨噬細(xì)胞（CD45+CD11b-Ly6G-F4/80+）比例由原來(lái)的11.8%分別降低至6.4%、4.0%和3.5%（圖2C）。上述結(jié)果表明，poly（I：C）和LPS聯(lián)合刺激誘導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞和間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主，并存在肺泡巨噬細(xì)胞耗竭，提示中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量招募參與poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導(dǎo)的急性肺臟損傷。

2.3 Poly（I：C）和LPS聯(lián)合刺激誘導(dǎo)補(bǔ)體C3活化通過(guò)Western blot檢測(cè)小鼠肺臟組織和巨噬細(xì)胞系中補(bǔ)體C3蛋白的酶解變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于PBS組，聯(lián)合刺激組小鼠肺臟總C3蛋白表達(dá)增加，并且C3活化裂解后產(chǎn)生的α鏈、iC3b片段和C3c片段也明顯增多（圖3A）。體外實(shí)驗(yàn)對(duì)RAW264.7細(xì)胞系進(jìn)行poly（I：C）和/或LPS刺激。相較于PBS組，聯(lián)合刺激同樣誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞總C3蛋白水平和活化裂解產(chǎn)生的C3c片段增加（圖3B）。提示poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激可誘導(dǎo)補(bǔ)體C3的表達(dá)和活化增加。

圖1 Poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激加重肺臟組織病理變化Fig.1 Poly（I：C）combined with LPS stimulation aggravated lung tissue pathological changes

2.4 Ficolin參與介導(dǎo)poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導(dǎo)的補(bǔ)體C3活化通過(guò)Western blot檢測(cè)ficolin敲除小鼠聯(lián)合刺激后肺臟補(bǔ)體C3蛋白的表達(dá)和活化變化。結(jié)果顯示，在PBS組，F(xiàn)cna-/-和Fcnb-/-小鼠的C3蛋白表達(dá)和活化較野生型小鼠無(wú)明顯差異（圖4）；而在poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激組，F(xiàn)cna-/-和Fcnb-/-小鼠的總C3蛋白表達(dá)和活化后產(chǎn)生的片段較野生型小鼠均明顯降低（圖4）。提示ficolin可能參與聯(lián)合刺激誘導(dǎo)的小鼠肺臟補(bǔ)體C3活化。

圖2 Poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激大量招募中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞耗竭Fig.2 Poly（I：C）combined with LPS stimulation recruits in large numbers of neutrophils and macrophages and induces exhaustion of alveolar macrophages

圖3 Poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導(dǎo)補(bǔ)體C3表達(dá)和活化增加Fig.3 Poly（I：C）combined with LPS stimulation induces increased expression and activation of complement C3

2.5 敲除ficolin緩解poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導(dǎo)的急性肺損傷進(jìn)一步利用Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠研究ficolin在poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導(dǎo)小鼠肺臟損傷中的作用。在PBS對(duì)照組，ficolin敲除小鼠和野生型小鼠的肺組織病理學(xué)變化均無(wú)明顯差異，但在poly（I：C）單獨(dú)或聯(lián)合LPS刺激組，F(xiàn)cna-/-和Fcnb-/-小鼠較野生型小鼠肺內(nèi)支氣管和血管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺泡融合和彌漫性損傷減輕，支氣管腔內(nèi)出血及病理?yè)p傷程度明顯減輕（圖5）。提示ficolin通過(guò)激活補(bǔ)體參與poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。

圖4 敲除ficolin降低poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導(dǎo)的補(bǔ)體C3活化Fig.4 Knockout of ficolin reduces activation of complement C3 induced by poly（I：C）combined with LPS stimulation

圖5 Ficolin敲除對(duì)poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激后肺組織病理變化的影響Fig.5 Effect of ficolin knockout on pathological changes of lung tissue after poly（I：C）combined with LPS stimulation

2.6 敲除ficolin緩解poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導(dǎo)的間質(zhì)巨噬細(xì)胞募集和肺泡巨噬細(xì)胞耗竭利用Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠研究ficolin在poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激對(duì)小鼠肺臟中性粒細(xì)胞、間質(zhì)巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的變化影響。結(jié)果顯示，在聯(lián)合刺激后第5天，ficolin敲除小鼠和野生型小鼠肺臟中性粒細(xì)胞的比例變化無(wú)顯著差異（圖6A）；Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠相較于野生型小鼠，間質(zhì)巨噬細(xì)胞比例由33.9%分別降低至10.7%和16.1%（圖6B），而肺泡巨噬細(xì)胞比例由3.81%分別升高至5.93%和5.97%（圖6C）。提示ficolin參與poly（I：C）和LPS聯(lián)合刺激中間質(zhì)巨噬細(xì)胞的募集和肺泡巨噬細(xì)胞的耗竭。

圖6 Ficolin敲除對(duì)poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激后肺臟中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比例的影響Fig.6 Effect of ficolin knockout on proportions of neutrophils and macrophages in lung after poly（I：C）combined with LPS stimulation

3 討論

呼吸道病毒感染嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，而病毒感染后繼發(fā)細(xì)菌感染是導(dǎo)致肺臟急性損傷加重和病死率升高的重要因素之一，其中的免疫學(xué)機(jī)制尚不完全清楚，尤其是補(bǔ)體ficolin是否參與病毒繼發(fā)細(xì)菌感染誘導(dǎo)的急性肺損傷還未有研究闡明。深入探究聯(lián)合感染損傷加重的發(fā)生機(jī)制，有利于尋找潛在的治療靶點(diǎn)，從而緩解病毒繼發(fā)細(xì)菌感染誘導(dǎo)的急性肺損傷并降低致死率［15］。

RNA病毒侵入靶細(xì)胞后形成的dsRNA可作為主要的PAMPs與靶細(xì)胞內(nèi)的PRRs結(jié)合，如Toll樣受體3（TLR3）或視黃酸誘導(dǎo)基因（RIG-Ⅰ），誘導(dǎo)下游信號(hào)通路的激活和促炎細(xì)胞因子/趨化因子的分泌［16］。繼發(fā)細(xì)菌感染后，革蘭氏陰性菌主要致病物質(zhì)LPS可激活TLR4，同樣引起下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及促炎因子分泌［17］。目前用不同病毒和細(xì)菌建立各種組合感染的模型比較困難，并且之前已有研究證明通過(guò)使用病毒RNA模擬物poly（I：C）激活抗病毒免疫反應(yīng)足以對(duì)宿主抗細(xì)菌免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響［13］。而且poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激導(dǎo)致的肺臟病理變化與流感病毒繼發(fā)細(xì)菌感染相似，如肺損傷面積增多，肺泡廣泛萎縮，并伴有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)［18］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)滴鼻poly（I：C）和革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素LPS模擬病毒繼發(fā)細(xì)菌感染所誘導(dǎo)的急性肺臟損傷，并進(jìn)一步探究其中的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。

本研究建立了LPS誘導(dǎo)的poly（I：C）預(yù)刺激的小鼠急性肺臟損傷模型，證實(shí)聯(lián)合刺激組小鼠肺臟病理較PBS組和單獨(dú)刺激組小鼠加重，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合刺激大量招募中性粒細(xì)胞和間質(zhì)巨噬細(xì)胞進(jìn)入肺臟，證實(shí)聯(lián)合刺激明顯誘導(dǎo)小鼠肺臟和RAW264.7細(xì)胞中補(bǔ)體C3的表達(dá)與酶解活化，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體ficolin在此模型中可能介導(dǎo)C3的活化，敲除ficolin明顯減輕聯(lián)合刺激誘導(dǎo)的小鼠肺臟病理?yè)p傷，以及降低間質(zhì)巨噬細(xì)胞的募集和肺泡巨噬細(xì)胞的耗竭。提示ficolin通過(guò)激活補(bǔ)體參與poly（I：C）聯(lián)合LPS刺激誘導(dǎo)的急性肺損傷。

既往研究發(fā)現(xiàn)ficolin在單獨(dú)病毒或細(xì)菌感染中都發(fā)揮作用，并且ficolin能增強(qiáng)IL-1、IL-6、TNF-α等促炎因子和CXCL1/2/10、CCL14等趨化因子的表達(dá)，并抑制抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重［19-22］，而目前仍未有研究闡明ficolin在聯(lián)合感染導(dǎo)致肺臟損傷加重中的作用及機(jī)制。本研究通過(guò)使用RNA病毒和革蘭氏陰性菌相應(yīng)的PAMPs模擬聯(lián)合感染過(guò)程，初步闡明ficolin通過(guò)活化補(bǔ)體促進(jìn)肺臟炎癥反應(yīng)以及促進(jìn)間質(zhì)巨噬細(xì)胞募集和肺泡巨噬細(xì)胞耗竭，從而加重肺臟免疫損傷，為呼吸道RNA病毒繼發(fā)革蘭氏陰性菌感染的預(yù)防和治療提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn)和新的方向。