楊秀麗

(呼和浩特職業(yè)學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生系，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051)

野生藍(lán)莓為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium spp.)多年生落葉或常綠灌木型果樹，因果實(shí)多呈現(xiàn)藍(lán)色，所以通常稱為藍(lán)莓(Blueberry)。越橘屬植物分布廣泛，從熱帶一直到北極圈都有，全屬計約300種以上，但集中分布于東南亞熱帶高山、東亞溫帶和亞熱帶、中南美洲以及北美東部4個地區(qū)[1]。越桔屬植物在我國約產(chǎn)65種，集中分布于西南幾省，特別是云南分布的種類約占全國1/2左右，但大多數(shù)種類尚未發(fā)現(xiàn)其經(jīng)濟(jì)利用價值。有利用價值的除烏飯樹(Vaccinium.sprengelii Sleumer)分布較廣，在11個省有零星分布以外，篤斯越橘(Vaccinium uliginosum L)、紅豆越橘(Vaccinium vitis-idaea L.)和蔓越橘(Vaccinium macrocarpon L.)都局限于東北地區(qū)，蘊(yùn)藏量相當(dāng)大，有開發(fā)利用價值[2]。其中，篤斯越橘經(jīng)濟(jì)利用價值最高，在當(dāng)?shù)乇涣謪^(qū)被林區(qū)人們開發(fā)成多種特色產(chǎn)品，具有可觀的經(jīng)濟(jì)收益。而且篤斯越橘耐寒性極強(qiáng)，可抵御-50℃的低溫，是森林中天然生長的野生水果資源[3]。大興安嶺素以高寒著稱，被認(rèn)為是水果栽培的禁地，而野生篤斯越橘(野生藍(lán)莓)卻生長繁茂，如果能對其有效的開發(fā)利用，對本地經(jīng)濟(jì)有積極的補(bǔ)充作用。

對藍(lán)莓的研發(fā)近年來也逐漸受到關(guān)注，本研究對大興安嶺地區(qū)野生藍(lán)莓根際土壤真菌的多樣性情況進(jìn)行調(diào)查研究，擬對本地區(qū)野生藍(lán)莓的資源保護(hù)、開發(fā)、利用提供本底數(shù)據(jù)。

筆者曾對本地區(qū)野生藍(lán)莓的菌根及其真菌進(jìn)行了研究，因野生藍(lán)莓與菌根菌形成了廣泛的互惠共生體——菌根。野生藍(lán)莓根系呈纖維狀，沒有根毛，但在自然狀態(tài)下，野生藍(lán)莓根系與菌根真菌共生形成杜鵑類菌根(Ericoid mycorrhiza ERM)，又稱毆石楠類菌根。ERM在促進(jìn)植物生長、提高養(yǎng)分吸收率、生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)及保護(hù)植物抵御不良環(huán)境脅迫中起關(guān)鍵作用[4-6]。許多與野生藍(lán)莓形成的菌根都被證明能促進(jìn)越橘對礦物質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收和利用，改善植株營養(yǎng)狀況，調(diào)節(jié)宿主的代謝活性，增強(qiáng)植株的抗逆性，提高越橘的產(chǎn)量，加快移栽苗成活速度，節(jié)約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和效益。因此對其菌根菌的研究很有必要?？晒P者在研究過程中，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)培養(yǎng)法無法準(zhǔn)確反映野生藍(lán)莓根際菌根菌和土壤中其他真菌的真實(shí)情況，因?yàn)楹芏嗾婢鷤鹘y(tǒng)方法培養(yǎng)不出來。

隨著核酸測序的快速發(fā)展，尤其是高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，拓展了人們對環(huán)境微生物的認(rèn)識，使其成為對難以培養(yǎng)微生物或不可培養(yǎng)微生物群落研究的技術(shù)策略，能夠讓人們直接從環(huán)境中獲取總DNA，并對其進(jìn)行測序分析[7]，從整體水平上盡可能揭示根際真菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性。本研究也采用了高通量測序技術(shù)對野生藍(lán)莓根際真菌群落特征進(jìn)行分析研究，得到了較全面的野生藍(lán)莓越桔根際真菌的群落數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)區(qū)位于內(nèi)蒙古大興安嶺森林生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站(以下簡稱大興安嶺森林生態(tài)站)。該站是國家林業(yè)局中國森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究網(wǎng)絡(luò)(CFERN)和科技部國家野外科學(xué)觀測研究網(wǎng)絡(luò)(CNERN)的站點(diǎn)成員，是我國緯度最高的、也是寒溫帶地區(qū)唯一的國家級森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站。該站地理坐標(biāo)為N50°49′～50°51′，E121°30′～121°31′。

在大興安嶺森林生態(tài)系統(tǒng)定位站附近原始林區(qū)選取有代表性的野生藍(lán)莓群落，采樣方法為5點(diǎn)法。采集野生藍(lán)莓根和根際土壤6份地表以下10～30cm的土層，混合為1個樣本，每個樣本30g。經(jīng)4.5mm孔徑篩網(wǎng)進(jìn)行過濾掉植物殘留物和顆粒，放入-20°C的冰箱保存[8]。

1.2 DNA提取

樣本取30g，利用Power Soil DNA TM extraction kit(MoBio Laboratories Inc.,Carlsbad,CA,USA)試劑盒提取。操作依據(jù)說明書進(jìn)入網(wǎng)站查詢(http://link.springer.com/article/10.1007/s10482-011-9624-8)。

采用引物ITS5-1737F：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；ITS2-2043R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC進(jìn)行擴(kuò)增。

采用 Illumina HiSeq測序平臺得到的下機(jī)數(shù)據(jù)，稱之為Raw PE，然后進(jìn)行拼接和質(zhì)控，得到Clean Tags，再進(jìn)行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)，即Effective Tags。

1.3 測序

北京諾禾致源生物信息科技有限公司代為測序。根據(jù)所擴(kuò)增的各區(qū)域特點(diǎn)，開發(fā)適用于該區(qū)域的數(shù)據(jù)質(zhì)控的軟件Microbial-weijie。完成建庫后利用MiSeq測序平臺測序，運(yùn)用軟件Microbial-weijie對產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控。

建庫測序：基于Illumina Miseq技術(shù)測序平臺，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行雙末端測序(Paired-End)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將得到的優(yōu)化序列通過聚類分析獲得OTUs,按相似度97%進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Units)的聚類，選取每個類最長的序列為代表序列然后調(diào)用RDP—classifier的方法，以RDP數(shù)據(jù)庫的序列為訓(xùn)練集對OTU代表序列進(jìn)行注釋，最終得到每個OTU分類學(xué)信息。

利用Qiime軟件對所有序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽取到的序列數(shù)與其所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，同時計算樣品中的真菌群落豐富度指數(shù)Chao1和多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 測序結(jié)果

根據(jù)高通量測序結(jié)果對序列進(jìn)行統(tǒng)計，見表1，測序共獲得clean reads 24090個,從樣本中獲得的優(yōu)質(zhì)序列長度分布在188～388bp，其中堿基數(shù)大于198bp的獲得優(yōu)質(zhì)序列24082條。

表1 獲得的序列情況

2.2 OTUs(operational taxonomic units)分析：OTU分析和物種注釋

為了研究樣品的物種組成多樣性，對所有樣品的過濾嵌合體后，最終用于后續(xù)分析的Effective Tags進(jìn)行聚類，以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，然后對OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋?；?7%的相似度水平，共獲得282個OTUs利用reads。

OTUs稀釋曲線來評估樣本的測序數(shù)據(jù)量是否足夠從稀釋曲線可以看出，見圖1,樣本的稀釋曲線均趨于平緩，說明測序趨于飽和，測得的數(shù)據(jù)可以反映土壤根際真菌群落的真實(shí)情況。

圖1 樣本的稀釋曲線

2.2.1 樣品中界門綱目科屬種情況

從樣品中共獲得有效序列17575條，在門水平上共得到14374條序列，占總序列81.787%，在屬種水平上共獲得序列14030條，占總序列的79.829%。

表2 界門綱目科屬種(k,p,c,o,f,g,s)水平上的Tags數(shù)目統(tǒng)計表

2.2.2 樣品的Tags及OTUs(operational taxonomic units)數(shù)目統(tǒng)計表

從樣品中獲得的有效序列總數(shù)為17575條，可以分類的序列數(shù)為15661條。獲得的操作分類單元(OTUs)282個。

表3 樣品的Tags及OTUs數(shù)目統(tǒng)計表

2.2.3 樣品中的真菌在門水平上的分類情況

282個OUTs分屬于真菌領(lǐng)域的3個門和4個潛在的菌門和其它未分類菌門。其中屬于子囊菌亞門的最多，占比0.707。

表4 樣品中的真菌分門統(tǒng)計表

2.2.4 樣品中占比前10的屬情況

樣品中14030個序列被確定分屬于165個屬，其中排名前10的屬見表5。Sordariomycetes屬真菌最多，占比0.275。

表5 樣品中的真菌分門統(tǒng)計表

2.2.5 單樣品中特定物種分類樹

樣品中的真菌，在分類樹上聚為4大類，子囊菌為最大的一類，占52.238%，擔(dān)子菌為第2大類，占6.508%，見圖2。

圖2 物種分類樹

2.3 樣品的Alpha多樣性分析

采用Alpha多樣性指數(shù)中的香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)和Chao1指數(shù)對樣品序列進(jìn)行了分析。Chao1指數(shù)為277.7771，Shannon為5.6502。

3 結(jié)論

從野生藍(lán)莓根部土壤中分離出的真菌隸屬于3個門和4個潛在的菌門和其它未分類菌門，分屬于165個屬。排位在前10的屬分別為Sordariomycetes，F(xiàn)usarium，Russula，Cephalotrichum，Trichoderma，Alternaria，Eupenicillium，Suillus，Un--s-fungal endophyte，Un--s-Ascomycota。

圖3 Chao1指數(shù)圖 圖4 Shannon指數(shù)圖

Alpha多樣性指數(shù)選擇香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)和Chao1指數(shù)對樣品序列進(jìn)行了分析。樣本的豐富度指數(shù)Chao1表明樣品中真菌豐富度水平較高，多樣性指數(shù)Shannon表明樣品中多樣性水平較高。

以DNA測序技術(shù)為基礎(chǔ)的新一代高通量測序技術(shù)使得對野生藍(lán)莓根際真菌群落的研究更全面直觀，比用傳統(tǒng)方法能探查到的真菌種類多得多。這與之前學(xué)者研究結(jié)果相似，即使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法無法準(zhǔn)確反映土壤中真菌的真實(shí)情況[9]，傳統(tǒng)方法僅能反映占土壤真菌總量的1%的可培養(yǎng)真菌的狀況，常用的克隆文庫分析則存在耗時耗力、通量低、分辨率低等的不足[10]。相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法以及克隆文庫等常規(guī)的分子生態(tài)學(xué)研究方法，高通量測序明顯擁有通量高、獲得信息豐富、快捷等優(yōu)勢[11]。

而且與筆者之前用傳統(tǒng)方法研究得出的結(jié)果相比較，本次從野生藍(lán)莓根際土壤中探查到165個屬的真菌，而傳統(tǒng)方法從野生藍(lán)莓根樣中分離得到的真菌分為6個類群：膜盤菌屬(Hymenoscyphus)真菌，Phialocephala真菌，粒毛盤菌屬(Lachnum)真菌，Cadophora真菌，擔(dān)子菌小皮傘屬(Marasmius),擔(dān)子菌小菇屬(Mycena)[12]。

這165個屬的真菌哪些是與篤斯越桔菌根有密切關(guān)系的類群，還需要進(jìn)一步的研究。