朱盼盼，孫海新，李兆新，邢麗紅，孫曉杰，鄭旭穎，張夢婷，王繼耀，周朝生，孫德祥

(1.青島大學生命科學學院，山東青島266100；2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質量安全檢測與評價重點實驗室，山東青島 266071；3.青島海洋科學與技術試點國家實驗室，山東青島 266237；4.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江溫州 325005；5.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室和溫州市海洋生物遺傳育種重點實驗室，浙江溫州 325005；6.安徽省水產(chǎn)技術推廣總站，合肥 230601)

呋喃西林屬于硝基呋喃類藥物，因抗菌譜廣，耐藥性好，曾經(jīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用。研究發(fā)現(xiàn)氨基脲主要以蛋白結合態(tài)形式長期穩(wěn)定存在，并通過食物鏈傳遞給消費者。結合態(tài)氨基脲在酸性條件下解離被人體吸收，進而危害健康。氨基脲對人體具有致誘變性和潛在的致癌性。游離態(tài)氨基脲存在周期短，對人體產(chǎn)生的危害低。1995年歐盟規(guī)定在動物源食品中不得檢出呋喃類殘留物，2003年歐盟規(guī)定氨基脲最大殘留限量值為1 μg/kg，對于蝦類規(guī)定在使用呋喃西林時，可食性組織中氨基脲最大殘留限量為0.5 μg/kg。1993年美國禁止在動物源食品中使用呋喃唑酮藥物，2004年美國食品和藥品管理局(FDA)公布了進口動物源性食品中包括呋喃西林和呋喃唑酮等禁用藥物名單。日本在2006年起規(guī)定禁止使用呋喃西林，氨基脲在蝦肌肉中檢測限為0.5 μg/kg。中國2002年頒布禁止使用呋喃西林，2005年將呋喃西林藥物列入廢止獸藥目錄。2019年我國規(guī)定蝦肌肉中氨基脲最大殘留限量為1 μg/kg。

研究表明在蝦類水產(chǎn)品中氨基脲含量較高，尤以日本沼蝦()和羅氏沼蝦()最為突出。根據(jù)調查發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖過程中并未使用呋喃西林藥物，因此探明蝦類水產(chǎn)品中氨基脲本底含量問題對正確認識蝦的食用安全性十分必要，對蝦類養(yǎng)殖業(yè)意義重大。已有研究證明氨基脲來源廣泛，除了使用呋喃西林藥物代謝產(chǎn)生外，在食品加工過程中會產(chǎn)生氨基脲。使用偶氮二甲酰胺或者次氯酸均會產(chǎn)生氨基脲。蝦類生物攝食的天然食物在體內(nèi)可能轉化為氨基脲，溫度也是導致氨基脲產(chǎn)生的一個因素。氨基脲作為內(nèi)源性物質普遍存在于蝦類水產(chǎn)品中。

研究表明氨基脲在蝦組織中存在結合態(tài)和游離態(tài)2種形態(tài)。研究表明，新鮮北海地區(qū)蝦的甲殼組織中存在結合態(tài)的氨基脲，羅氏沼蝦甲殼組織中結合態(tài)氨基脲占總氨基脲比例大于65%，日本沼蝦甲殼中結合態(tài)氨基脲占總氨基脲比例為84.37%。在凡納濱對蝦肌肉組織中游離態(tài)氨基脲所占比例為95%，羅氏沼蝦肌肉組織中游離態(tài)氨基脲占比為100%，日本沼蝦肌肉組織中游離態(tài)氨基脲占總氨基脲比例為51.7%～69.11%。在日本沼蝦的足、肝胰腺團、眼柄和鰓中游離態(tài)氨基脲占總氨基脲比例分別為20.99%、94.90%、54.70%、19.87%。蝦類品種繁多，不同品種、不同地域、不同養(yǎng)殖條件下蝦中氨基脲的存在形態(tài)和分布特征尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究詳細探討了氨基脲在蝦中的組織分布、存在形態(tài)、海水和淡水品種差異，以及湖泊和池塘生長環(huán)境的差異，為正確認識蝦中氨基脲殘留提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

人工養(yǎng)殖蝦樣品分別采自安徽省和青島市的人工養(yǎng)殖池塘；野生蝦樣品分別采集于安徽省內(nèi)的天然湖泊和青島沿海海域。每個地點采集3個蝦樣本(=3)，每個樣本按蝦的大小體重不同采集不同的數(shù)量，日本沼蝦()、羅氏沼蝦()、克氏原螯蝦()、秀麗白蝦()、凡納濱對蝦()、脊尾白蝦()、日本對蝦()每150尾為一個樣本。中國對蝦()、鷹爪蝦()、口蝦蛄()每30尾為1個樣本。采集的日本沼蝦迅速放入液氮罐，并運到實驗室。所有樣品均未使用藥物。樣品信息見表1。

表1 蝦樣品品種、樣品量及來源(n=3)Tab.1 Variety,sample quantity and source of shrimp

1.2 化學試劑

氨基脲鹽酸鹽(德國Dr.Ehrenstorfer公司)，內(nèi)標物C,N-SEM(上海泰坦科技股份有限公司)；鹽酸和磷酸氫二鉀(優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司)、醋酸銨(色譜純，北京伊諾凱科技有限公司)、2-硝基苯甲醛(色譜純，生工生物工程股份有限公司)、甲酸(色譜純，青島海沃森生物科技有限公司)；甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)、乙酸乙酯(色譜純，青島騰岳海邦化工有限公司)。

1.3 設備

QTRAP?5500液相色譜-串聯(lián)質譜儀(配ESI離子源，美國AB SCIEX公司)；分析天平(感量0.01 g，德國賽多利斯集團)；Vortex 2渦旋混合器(德國IKA公司)；IS-RDS3恒溫振蕩器(美國精騏有限公司)；Himac GR22G高速離心機(日本日立公司)；N-EVAP 112氮氣吹干儀(美國Organomation 公司)；微量高速離心機(德國Sigma公司)；Gradient A10 Mill-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.4 標準溶液配制

1.4.1 氨基脲標準溶液

準確稱取14.9 mg氨基脲鹽酸鹽標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成1 mg/mL的標準儲備溶液，-18 ℃冷藏保存。使用時用甲醇逐級稀釋，配制成1 μg/mL、100 ng/mL和10 ng/mL的標準溶液。

1.4.2 內(nèi)標標準溶液

準確稱取適量內(nèi)標標準品C,N-SEM，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成1 mg/mL的內(nèi)標標準儲備溶液。使用時用甲醇逐級稀釋，配制成100 ng/mL的內(nèi)標標準工作液。

1.5 樣品前處理方法

1.5.1 樣品制備

取蝦類樣品的甲殼、肌肉、鰓、肝胰腺、頭胸部、眼柄組織，用均質機混勻，每個樣本組織大于20 g，-80 ℃保存。

1.5.2 氨基脲總量的測定

樣品組織中殘留的硝基呋喃代謝物直接經(jīng)酸解、衍生化后，LC-MS/MS測試蝦中氨基脲總量。

(1)水解和衍生化

準確稱取1 g樣品于50 mL離心管中，加入內(nèi)標標準工作液100 μL，渦旋混合1 min，再加入0.5 mol/L鹽酸溶液5 mL和0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛150 μL，渦旋混合震蕩90 s，置于恒溫振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。

(2)提取和凈化

取出離心管冷卻至室溫，加入1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液5 mL，調節(jié)pH至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩90 s，4 000 r/min離心5 min，取上清液轉移至10 mL試管中于40 ℃下氮氣吹干。準確加入5%甲醇水溶液渦旋振蕩溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，待測。

1.5.3 結合態(tài)氨基脲含量的測定

采用甲醇以及不同濃度的甲醇水溶液洗滌樣品去除樣品中游離態(tài)氨基脲。分別稱取適量均質后的蝦組織樣品(甲殼、肌肉、鰓、眼柄、肝胰腺、頭胸部)于50 mL離心管中，分別加入5 mL 50%甲醇/水溶液，渦旋混合50 s，超聲提取5 min，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液。再依次加入5 mL75%甲醇/水溶液重復上述操作。洗滌后的樣品采用1.5.2的方法進行處理，經(jīng)LC-MS/MS測試，測得結合態(tài)氨基脲含量。

1.5.4 標準工作曲線的制作

分別準確移取10 ng/mL氨基脲標準工作溶液50、100、200μL，100 ng/mL標準工作溶液50、100、200 μL和1 μg/mL標準工作溶液50 μL于7個50 mL離心管中。除不加樣品外，按照1.5.2的測定操作，進LC-MS/MS分析，繪制標準曲線。

1.5.5 色譜條件和質譜條件

色譜條件：色譜柱為Waters Xbridge C柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動相A為0.002 mol/L醋酸銨溶液，流動相B為100%甲醇溶液，流動相梯度洗脫條件：0～0.5 min，90% A；0.5～4.0 min，90%～5% A；4.0～5.5 min，5% A；5.5～6.0 min，5%～90% A；6.0～7.0 min，90% A ；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃。

質譜條件：離子源為ESI源，正離子掃描；離子源溫度為550 ℃，去溶劑溫度為380 ℃，噴霧電壓5 500 V，碰撞氣壓力：中等；氣簾氣：206.85 kPa；霧化氣：241.33 kPa；去簇電壓：80 V；輔助加熱氣：241.33 kPa；錐形氣流：344.75 kPa。數(shù)據(jù)采集采用多反應監(jiān)測模式(MRM)。所監(jiān)測的目標離子分別為氨基脲209.0>166.0(碰撞能量11 eV)和C,N-氨基脲212.0>168.0(碰撞能量13 eV)。數(shù)據(jù)處理采用MultiQuant軟件。

2 結果與分析

2.1 方法適用性評價

2.1.1 方法的準確度和精密度

實驗對方法的適用性進行了驗證，氨基脲平均回收率為74.3%～113.5%，精密度小于6.3%。

2.1.2 方法的線性范圍與檢測限

按1.4的方法配制標準工作液，經(jīng)過液相色譜-串聯(lián)質譜儀檢測后，以濃度為橫坐標，氨基脲峰面積與內(nèi)標物峰面積比值為縱坐標，繪制標準工作曲線。結果表明，氨基脲在0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系，回歸方程為=-0001 075-0033 7，=0.999。

2.2 蝦類產(chǎn)品中氨基脲總量、結合態(tài)氨基脲含量及其所占比例

蝦類產(chǎn)品不同組織中氨基脲總量、結合態(tài)氨基脲含量及結合態(tài)氨基脲占氨基脲總量的比例見表2。

表2 蝦產(chǎn)品不同組織中氨基脲總量和結合態(tài)氨基脲含量Tab.2 The contents of total semicarbazide and bound semicarbazide in different tissues of shrimp products μg/kg

表2結果顯示，在淡水蝦(日本沼蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和秀麗白蝦)和海水蝦(中國對蝦、凡納濱對蝦、口蝦蛄、鷹爪蝦、脊尾白蝦和日本對蝦)的甲殼、眼柄、鰓組織中均檢出氨基脲，氨基脲含量范圍分別為(1.05±0.11)～(855.39±10.55) μg/kg、ND～(106.3±21.47) μg/kg、ND～(32.15±4.14) μg/kg?？傮w而言，不同組織中氨基脲濃度從高到低依次為：甲殼>眼柄>鰓>肌肉>頭胸部>肝胰腺。

生長在湖泊和池塘淡水環(huán)境中的日本沼蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和秀麗白蝦等的甲殼、眼柄和鰓中氨基脲范圍分別為(9.13±1.07)～(855.39±10.55) μg/kg、(12.61±2.09)～(106.3±21.47) μg/kg、(3.24±0.06)～(32.15±4.14) μg/kg，海水環(huán)境中的中國對蝦、凡納濱對蝦、口蝦蛄、鷹爪蝦、脊尾白蝦和日本對蝦等甲殼、眼柄和鰓中氨基脲范圍分別為(1.05±0.11)～(9.90±1.09) μg/kg、ND～(2.83±0.16) μg/kg、ND～(4.78±1.33) μg/kg。本研究發(fā)現(xiàn)，淡水蝦中甲殼、眼柄和鰓組織中氨基脲含量比海水蝦相應組織中氨基脲含量高。

淡水蝦可食組織肌肉中濃度范圍為(1.88±0.90)～(16.94±0.14) μg/kg，均大于殘留限量1.0 μg/kg，其中肌肉組織中結合態(tài)氨基脲濃度范圍為ND～(4.89±0.15) μg/kg，結合態(tài)氨基脲占氨基脲總量的12.7～28.9%，而在海水蝦肌肉中普遍未檢出氨基脲(<0.1 μg/kg)。

結果表明，蝦甲殼組織和眼柄組織中氨基脲主要以結合態(tài)形式存在，其結合態(tài)氨基脲所占比例超過50%，而肌肉、鰓、肝胰腺、頭胸部組織中氨基脲主要以游離態(tài)形式存在，其結合態(tài)氨基脲所占比例均低于50%。

2.3 湖泊野生與池塘養(yǎng)殖的日本沼蝦氨基脲含量特征

2.3.1 養(yǎng)殖和野生日本沼蝦氨基脲總量對比分析

分別對養(yǎng)殖和野生日本沼蝦不同組織中氨基脲的含量進行統(tǒng)計分析，結果見圖1。

養(yǎng)殖池塘采集的日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織氨基脲含量范圍分別為(521.61±10.43)～(855.39±10.55) μg/kg、(67.85±10.67)～(95.03±21.79) μg/kg、(11.45±2.27)～(32.15±4.14) μg/kg、(14.01±0.55)～(19.37±1.34) μg/kg、(7.66±0.79)～(15.56±3.13) μg/kg、(8.53±0.17)～(16.94±0.14) μg/kg，湖泊采集的日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織氨基脲含量范圍分別為(312.97±21.28)～(404.08±12.43) μg/kg、(87.58±10.32)～(106.3±21.47) μg/kg、(7.60±0.89)～(18.77±1.14) μg/kg、(5.48±1.16)～(7.62±1.12) μg/kg、(11.19±1.13)～(14.32±3.15) μg/kg、(6.27±0.23)～(13.94±0.15) μg/kg。圖1結果顯示養(yǎng)殖池塘采集的日本沼蝦甲殼、鰓、頭胸部、肌肉組織氨基脲含量均高于湖泊采集的日本沼蝦氨基脲含量。

圖1 野生和養(yǎng)殖日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織中氨基脲含量Fig.1 Content of total semicarbazide in shell,eyestalk,gill,cephalothorax,hepatopancreas and muscle of wild and cultured M.nipponense

2.3.2 日本沼蝦結合態(tài)氨基脲含量分析

分別對養(yǎng)殖和野生日本沼蝦不同組織中結合態(tài)氨基脲的含量進行統(tǒng)計分析，結果見圖2。

養(yǎng)殖池塘采集的日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織結合態(tài)氨基脲含量范圍分別為(427.23±1.98)～(510.01±3.14) μg/kg、(53.75±4.13)～(81.02±11.89) μg/kg、ND～(1.01±0.02) μg/kg、ND～(3.58±0.14) μg/kg、未檢出～(1.37±0.09) μg/kg、(1.71±0.06)～(4.89±0.15) μg/kg，湖泊采集的日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織結合態(tài)氨基脲含量范圍分別為(256.67±10.16)～(340.8±4.57) μg/kg、(76.38±7.56)～(93.79±11.10) μg/kg、(0.74±0.09)～(6.88±1.08) μg/kg、(0.67±0.04)～(2.14±0.06) μg/kg、(0.36±0.13)～(2.93±0.64) μg/kg、(1.38±0.12)～(3.64±0.93) μg/kg。圖2結果顯示，養(yǎng)殖日本沼蝦甲殼、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織結合態(tài)氨基脲含量均高于野生日本沼蝦結合態(tài)氨基脲含量，在甲殼、眼柄組織中氨基脲主要是結合態(tài)形式存在，其它組織中氨基脲以游離態(tài)形式存在。

圖2 野生和養(yǎng)殖日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織中結合態(tài)氨基脲含量Fig.2 Content of bound semicarbazide in shell,eyestalk,gill,cephalothorax,hepatopancreas and muscle tissue of wild and cultured M. nipponense

3 討論

本研究結果表明，在人工養(yǎng)殖環(huán)境和野生環(huán)境下蝦中氨基脲含量存在一定差異，但其組織分布呈現(xiàn)相似的規(guī)律，不同組織中氨基脲含量從高到低依次為：甲殼>眼柄>鰓>肌肉>頭胸部>肝胰腺。由于采樣時間、地點等因素的差異，不同品種蝦的不同組織氨基脲含量存在差異。另有研究表明，在蜂等昆蟲的殼中存在氨基脲，氨基脲是昆蟲殼組織的成分基團。以上研究均表明，氨基脲作為內(nèi)源性物質在不同品種蝦的甲殼組織中普遍存在，且含量最高。

氨基脲在蝦不同組織中的存在形態(tài)也各不相同。宋蓓等研究日本沼蝦不同組織中氨基脲存在形態(tài)，發(fā)現(xiàn)殼中氨基脲以結合態(tài)形式存在且所占比例大于50%，與本研究結果一致。甲殼、眼柄、鰓等蝦的角質化組織中結合態(tài)氨基脲所占比例大于肌肉組織中結合態(tài)氨基脲的比例。由于甲殼類生物生長過程中具有脫殼行為，因此氨基脲在不同組織中的相關關系及轉化、平衡機制有待深入研究。

來源于不同生長環(huán)境的蝦組織中氨基脲含量存在差異。本研究通過對淡水蝦和海水蝦中氨基脲含量進行對比分析發(fā)現(xiàn)，氨基脲在中國對蝦、凡納濱對蝦、口蝦蛄、鷹爪蝦、脊尾白蝦和日本對蝦等海水蝦肌肉組織中小于0.1 μg/kg，在日本沼蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和秀麗白蝦等淡水蝦的可食性肌肉中含量較高，在日本沼蝦、羅氏沼蝦肌肉組織中平均含量均大于1.0 μg/kg，表明氨基脲主要存在于淡水環(huán)境生長的蝦中。其它研究也表明在淡水中生長的蝦肌肉組織中存在氨基脲，如來源于不同地區(qū)的克氏原螯蝦肌肉組織中氨基脲含量分別為(0.52±0.03) μg/kg和4.2～12 μg/kg，說明不同生長環(huán)境下淡水蝦中氨基脲含量也存在一定差異。上述研究表明，日本沼蝦在不同環(huán)境條件下，其不同組織中氨基脲含量存在差異，這種差異可能與日本沼蝦的養(yǎng)殖環(huán)境或飼料的影響的有關。水體、底泥或飼料中含有的氨基脲或氨基脲基團，亦或其它腐殖質對蝦體內(nèi)氨基脲含量的影響機制有待進一步研究。